廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科 （福建 廈門 361000）

內(nèi)容提要：目的：探討自組裝多肽/珊瑚/BMP-2這一材料復(fù)合體作為骨組織工程材料的可能性，研究自組裝多肽/珊瑚/BMP-2這一材料復(fù)合體中的各個成分能否取長補短，為骨折修復(fù)策略提供有價值的研究數(shù)據(jù)。方法：實驗于2014年3月～2015年3月在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院骨科中心實驗室中完成，將骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）和進行共培養(yǎng)，分為3組進行對照研究。觀察組1：RADA16/珊瑚/BMP-2組；觀察組2：RADA16/珊瑚組；對照組：珊瑚組。觀察復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）與BMSCs的細胞相容性，分析自組裝多肽/珊瑚/BMP-2這一材料復(fù)合體對兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的生物學(xué)行為的影響。結(jié)果：BMSCs生長發(fā)育良好，分布均勻，呈現(xiàn)出良好的態(tài)勢。培養(yǎng)3d后，3個組別均未明顯發(fā)現(xiàn)存在死亡細胞。BMSCs和不同系統(tǒng)的細胞相容性良好。結(jié)論：復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）在體外顯示了良好的細胞相容性及生物學(xué)活性，良好的超微結(jié)構(gòu)，可能成為骨組織修復(fù)工程中的優(yōu)質(zhì)材料。

在骨組織工程的生物材料領(lǐng)域中自組裝多肽是新的研究熱點，其具有許多優(yōu)點：模擬自然細胞外基質(zhì)環(huán)境、機械強度適中以及高密度同時可設(shè)計的活性表位等，在骨組織工程中具有很好的應(yīng)用前景[1,2]。在本課題的前期研究中，已經(jīng)驗證了珊瑚材料對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）促進細胞黏附、生長和分化的作用。本研究將骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）和進行共培養(yǎng)，觀察自組裝多肽/珊瑚/BMP-2這一材料復(fù)合體對兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的生物學(xué)行為的影響，探討自組裝多肽/珊瑚/BMP-2這一材料復(fù)合體作為骨組織工程材料的可能性，為骨折修復(fù)策略提供有價值的研究數(shù)據(jù)。

1.材料與方法

1.1 一般資料

自2014年3月～2015年3月于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院骨科中心實驗室。普通級日本大耳白兔1只（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心），5周齡。珊瑚，BMP-2，DMEM/F12培養(yǎng)基，CaCl2溶液，10%蔗糖溶液，PBS緩沖液。分組情況如下：觀察組1：RADA16+珊瑚+BMP-2組；觀察組2：RADA16+珊瑚組；對照組：珊瑚組。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定。取實驗白兔，使用電推刮除白兔取材處毛發(fā)，并處死。在無菌條件下于股骨處分離出一段肌肉及筋膜組織，并取出一側(cè)股骨。為防止干擾，將剝脫下的股骨上附著的軟組織盡量刮除干凈。將股骨兩端剪開，暴露髓腔。使用裝有10mL混合適量肝素鈉的無血清細胞培養(yǎng)基的無菌注射器，使用此混合液將股骨內(nèi)的骨髓沖入培養(yǎng)皿。無菌操作下，將反復(fù)吹打均勻骨髓并離心。離心后可見分為明顯的三層。傾斜離心管，將單核細胞層吸出并放置于另一個離心管當(dāng)中，并用無血清細胞培養(yǎng)基洗洚2次（5min，l000r/min），同時棄掉上清液加入培養(yǎng)基并反復(fù)吹打形成單細胞懸液。

1.2.2 復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）的準備。超聲震蕩RADA16溶液30min，將60μL的多肽溶液平均放置于24孔的Transwell的insert小室中（insert小室直徑6.5mm），使其形成大約1mm厚度（觀察組1：RADA16/珊瑚/BMP-2組；觀察組2：RADA16/珊瑚組；對照組：珊瑚組）。加入等體積的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基，從而促進自組裝（注意緩慢加入）。將完成的insert小室放入37?C溫箱孵育30min，之后將insert小室取出。觀察到自組裝多肽形成水凝膠后，用DMEM/F12細胞培養(yǎng)基輕輕漂洗insert小室內(nèi)的水凝膠。12h漂洗3次，在最后1次漂洗后，將insert小室放置過夜。

1.2.3 復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）與BMSCs的細胞相容性。在37.0?C，5% CO2濃度和飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細胞鋪滿瓶底80%～90%時使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第3代細胞做流式鑒定。將BMSCs培養(yǎng)至第三代，選取生長狀態(tài)良好的部分，使用0.25%胰蛋白酶將其消化。收集消化后的細胞，制備BMSCs單細胞懸液。將BMSCs以2×105個/mL濃度接種于復(fù)合材料體系（觀察組1：RADA16/珊瑚/BMP-2組；觀察組2：RADA16/珊瑚組；對照組：珊瑚組）表面。接種了BMSCs的復(fù)合材料中，再加入DMEM/F12細胞培養(yǎng)基。將其放入恒溫37?C、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2d換液，分別混合培養(yǎng)至3d，7d，14d后，取出，PBS漂洗2遍，加入PI&Ca-am染料染色，37?C孵育30min后，使用熒光及激光顯微鏡觀察細胞存活情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及形態(tài)學(xué)鑒定（骨髓間充質(zhì)干細胞）

BMSCs顯示的細胞形態(tài)見圖1。BMSCs生長發(fā)育良好，分布均勻，呈現(xiàn)出良好的態(tài)勢。

圖1.BMSCs顯示的細胞形態(tài)

圖2.培養(yǎng)3d后，BMSCs和不同系統(tǒng)的細胞相容性（2a.觀察組1：RADA16+珊瑚+BMP-2組；2b.觀察組2：RADA16+珊瑚組；2c.對照組：珊瑚組。）

2.2 復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）對BMSCs的毒性研究

圖2顯示，培養(yǎng)3d后，BMSCs和不同系統(tǒng)的細胞相容性良好。生存細胞會發(fā)出綠色的熒光，死亡細胞會發(fā)出紅色的熒光。3個組別均未明顯發(fā)現(xiàn)存在死亡細胞。

珊瑚在材料體系中扮演了剛性的“鋼筋混凝土”樣的結(jié)構(gòu)地位，為整個材料體系提供了足夠的機械強度；同時，其主要成分也為構(gòu)建成骨細胞微環(huán)境提供了重要保障。自組裝多肽RADA16在DMEM/F12細胞培養(yǎng)基觸發(fā)下形成水凝膠，性質(zhì)柔軟，含水量高[4]。掃描電子顯微鏡證實其形成了納米級別的纖維與層狀結(jié)構(gòu)。RADA16凝膠支架細胞相容性，細胞學(xué)毒性，促進BMSCs的黏附和向成骨細胞分化這幾個方面都顯示出了優(yōu)異的良性結(jié)果。復(fù)合材料體系全部由氨基酸，天然材料和成分組成，生物相容性好，無明顯毒性，易代謝，無明顯排異反應(yīng)；珊瑚的孔隙結(jié)構(gòu)與自組裝多肽形成的三維結(jié)構(gòu)與骨組織結(jié)構(gòu)相近；珊瑚孔隙率高，自組裝多肽凝膠含水量高，達95%以上，營養(yǎng)物質(zhì)易于運輸，代謝廢物易于排出。

3.討論

適宜的種子細胞一直是組織工程研究者關(guān)注的重點。干細胞在給定的條件下可向不同類型的細胞加以分化，同時，干細胞的合成與代謝能力也比成熟成體細胞更為成熟與優(yōu)秀。其在組織工程的種子細胞中具有廣闊的應(yīng)用前景。就骨組織工程本身來說，具有分化潛能的干細胞（比如骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs）可能是治療骨折變最理想的種子細胞。

優(yōu)異的生物學(xué)功能，良好的超微結(jié)構(gòu)，這兩點一直是組織工程研究者在尋找組織工程材料時所要求的基本要素。自組裝多肽納米纖維凝膠支架具有良好的三維生物學(xué)納米結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性和生物-材料界面相容性，目前已成為骨組織工程中頗具前景的生物材料。珊瑚作為自然生物材料，其基本理化性質(zhì)、孔隙率等與骨組織有著眾多相似性，在口腔科、頜面部整形方面已經(jīng)充當(dāng)著重要的應(yīng)用角色[3]。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白則可促進BMSCs向成骨細胞分化、增殖[4]。本研究中，將兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）與珊瑚、RADA16凝膠、BMP-2所形成復(fù)合材料體系進行共培養(yǎng)，研究復(fù)合材料體系對兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）生物學(xué)行為的影響，期待能為復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）和骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）聯(lián)合移植治療骨折提供可靠的實驗依據(jù)[5]。

本實驗結(jié)果表明：這種復(fù)合材料體系在體外顯示了良好的細胞相容性及生物學(xué)活性，但復(fù)合材料體系和BMSCs一起移植到供體后能否確實產(chǎn)生修復(fù)的預(yù)期結(jié)果還需進一步證實[3]。

將查閱的文獻和本次研究綜合來看，本次研究中的復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）與其他骨組織工程傳統(tǒng)材料相比，具有以下優(yōu)點：①全部由氨基酸，天然材料和成分組成，生物相容性好，無明顯毒性，易代謝，無明顯排異反應(yīng)；②珊瑚的孔隙結(jié)構(gòu)與自組裝多肽形成的三維結(jié)構(gòu)與骨組織結(jié)構(gòu)相近；③珊瑚孔隙率高，自組裝多肽凝膠含水量高，達95%以上，營養(yǎng)物質(zhì)易于運輸，代謝廢物易于排出。綜上所述，復(fù)合材料體系（自組裝多肽/珊瑚/BMP-2）在不久的將來將為骨組織修復(fù)工程貢獻新的力量。