韓海明 金偉 趙存新 史金勝 付金棟

(濰坊市益都中心醫(yī)院 1消化內(nèi)科，山東 濰坊 262500；2病理科；3日照市人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

胃癌屬于消化系統(tǒng)疾病，發(fā)病率居世界第四位，尤以東南亞和中國地區(qū)高發(fā)。在中國，胃癌的發(fā)病率在各種惡性腫瘤中占據(jù)首位，每年約有40萬新增患者〔1〕。近幾年來，胃癌患者的總體生存率明顯改善，但是預后仍然不佳，5年生存率約為20%〔2〕。目前，篩查胃腸疾病最常用的方法是胃鏡技術(shù)和組織學檢查，但這些方法不僅成本高，而且侵入性大，通常給患者帶來極大的痛苦。因此，尋找篩選診斷治療胃癌的方法對胃癌臨床治療意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)H19在膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤中的表達水平顯著異常，但關(guān)于它在胃癌中的表達變化情況少有報道〔3〕。研究表明，沉默信號調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)6在結(jié)腸癌組織中的表達比癌旁組織顯著下調(diào)，能夠作為診斷、治療結(jié)腸癌的新靶標〔4〕。目前有關(guān)lncRNA H19和SIRT6在胃癌中組織中的表達及與胃癌預后相關(guān)研究較少，本實驗初步探討lncRNA H19和SIRT6在胃癌中的表達情況，并分析二者與臨床病理特征及預后的關(guān)系，為胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料收集 收集2012年9月至2014年12月在濰坊市益教中心醫(yī)院實施手術(shù)治療的47例胃癌患者癌組織和癌旁組織(距胃癌組織3～5 cm)，平均年齡(62.39±7.63)歲；胃癌組織分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2010年修訂第七版的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期標準〔5〕，其中Ⅰ期9例、Ⅱ期11例、Ⅲ期13例、Ⅳ期14例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)(2000)病理組織學對腫瘤分化程度進行分類〔6〕，高分化(G1)18例，中分化(G2)19例，低分化(G3)10例。患者均符合胃癌疾病的診斷標準，術(shù)前均未接受放療或化療治療，且資料完整，對此次研究知情，并簽署知情同意書，同時排除患有其他惡性腫瘤的患者，且存在精神疾病或情緒不穩(wěn)定無法配合者。同時選取同時期在醫(yī)院體檢的40例健康體檢者為對照組男21例，女19例，平均年齡(61.41±7.53)歲。

1.2主要試劑 兔抗人SIRT6單克隆抗體購于美國 Cell Signaling Technology公司；通用型 SP 法免疫檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色盒均購于北京中杉金橋公司；TRIzol試劑盒、PCR引物均購于美國Invitrogen公司；SIRT6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒購于武漢Cusabio公司；過氧化氫、枸櫞酸、二甲苯、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.3qRT-PCR法檢測lncRNA H19和SIRT6的表達水平 采用TRIzol試劑分別提取胃癌癌組織和癌旁組織的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以β-actin為內(nèi)參，進行Real-time PCR檢測。H19上游引物序列5′-GAACACCTTAGGCTGGTG-3′，下游引物序列5′-ATGTTGTGG-GTTCTGGGAG-3′；SIRT6上游引物序列5′-CCCGGATCAACGGCTCTATC-3′，下游引物序列5′-GCCTTCACCCTTTTGGGGG-3′；β-actin上游引物序列5′-GAGCTACGAGCTGCCTGA-C-3′，下游引物序列5′-GGTAGTTTCGTGGATGCCACA-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，總共進行45個循環(huán)。

1.4免疫組化法檢測SIRT6蛋白表達 取手術(shù)后經(jīng)石蠟包埋的胃癌組織和癌旁組織切片(厚度4 μm)，將其分別于二甲苯、無水乙醇及磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行脫蠟處理，然后使用3%過氧化氫滅活內(nèi)源性氧化酶后，取出切片并使用PBS溶液洗滌3次，每次5 min。使用微波修復法對抗原進行修復，將切片置于枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)中，微波加熱至沸騰后進行冷卻，重復操作1次后用PBS清洗。清洗后取出切片，封閉10 min，加入SIRT6單克隆抗體，4 ℃孵育12 h。孵育后洗滌，先后滴加生物素標記的二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素，4℃各孵育20 min。孵育后再次洗滌，加入DAB顯色液染色5 min，之后經(jīng)沖洗、復染、脫水、封片后置于顯微鏡下進行觀察(×200)。從每個切片中選取5個高倍視野中隨機挑選并對陽性染色細胞數(shù)量進行統(tǒng)計。(1)按細胞核的染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞所占的百分比計分：小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。取上述兩項結(jié)果的乘積：≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.5ELISA檢測血清中SIRT6蛋白水平 采集胃癌患者及對照組的靜脈血5 ml。所有血樣經(jīng)分離得到血清低溫保存?zhèn)溆?。采用ELISA法對血清中SIRT6蛋白進行檢測，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6隨訪 對所有經(jīng)治療出院的胃癌患者進行復查或者電話隨訪，隨訪時間為3年，末次隨訪時間截止至2017年12月20日，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止期。觀察記錄隨訪期間患者的生存情況。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、兩獨立樣本t檢驗、χ2檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線評估lncRNA H19與SIRT6對胃癌的診斷價值；使用Kaplan-Meier方法計算胃癌患者存活率；采用Cox回歸模型多因素分析、Pearson進行相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA H19和SIRT6基因表達水平 與癌旁組相比，胃癌組H19表達水平明顯增加(P<0.05)，SIRT6表達水平明顯減少(P<0.001)，見表1。

表1 lncRNA H19和SIRT6表達水平(n=47)

2.2胃癌組織及癌旁組織中SIRT6蛋白表達 SIRT6蛋白陽性信號主要定位于細胞核。染色呈淡黃色、棕黃色(圖1)。胃癌組織中SIRT6蛋白無表達或表達量較低，癌旁組織中SIRT6蛋白表達明顯高于胃癌組織。與癌旁組織〔35例(74.47%)〕相比，胃癌組織中SIRT6陽性率明顯降低〔21例(44.68%)；χ2=8.658，P=0.003〕。

2.3血清中SIRT6蛋白表達 與對照組〔(452.36±10.26)pg/ml〕相比，胃癌患者血清中SIRT6蛋白表達顯著降低〔(349.27±9.73)pg/ml；t=48.034,P=0.000〕。

圖1 胃癌組織及癌旁組織中SIRT6蛋白表達(DAB，×200)

2.4H19和SIRT6對胃癌診斷價值分析 通過ROC曲線評估H19和SIRT6對胃癌診斷價值結(jié)果顯示，H19的ROC曲線下面積為0.773(95%CI0.676～0.871)，約登指數(shù)0.562，截斷值為3.52；SIRT6的ROC曲線下面積為0.709(95%CI0.604～0.814)，約登指數(shù)0.478，截斷值為0.76 pg/ml(圖2、圖3)。

圖2 H19診斷胃癌的ROC曲線

圖3 SIRT6診斷胃癌的ROC曲線

2.5H19和SIRT6基因在胃癌組織中的表達與臨床特征關(guān)系 分別根據(jù)H19和SIRT6診斷胃癌的ROC曲線選取的截斷值將47例胃癌患者分為高表達組和低表達組。H19和SIRT6表達水平與胃癌患者年齡、性別及腫瘤大小均無相關(guān)性(P>0.05)；H19和SIRT6表水平與腫瘤分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.6H19和SIRT6表達水平相關(guān)性分析 胃癌組織中H19和SIRT6表達水平呈正相關(guān)(r=-0.583，P=0.015)。見圖4。

2.7H19和SIRT6表達對胃癌患者生存期影響 H19高表達者3年生存率為42.3%顯著低于低表達者62.5%(P<0.05)；SIRT6高表達者3年生存率為51.8%顯著高于低表達者32.7%(P<0.05)。見圖5、6。

表2 H19、SIRT6與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

圖4 H19和SIRT6表達水平相關(guān)性

圖5 H19表達與胃癌生存期的關(guān)系

圖6 SIRT6表達與胃癌生存期的關(guān)系

2.8胃癌患者預后的多因素分析 采用Cox回歸模型分析顯示，腫瘤分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及H19和SIRT6表達是影響胃癌預后的獨立因素(P<0.05)。見表3。

表3 Cox回歸分析影響胃癌患者預后的因素

3 討 論

胃癌是多種基因變化積累的結(jié)果，目前其發(fā)病機制還不十分明確。胃癌在發(fā)病初期沒有較明顯的特征表現(xiàn)出來，一旦檢查確診，其病情程度往往十分嚴重。不同地區(qū)、國家及不同人群之間，胃癌的發(fā)病率和死亡率差別較大，約70%的胃癌患者發(fā)生在發(fā)展中國家。我國胃癌發(fā)病率也較高，早期胃癌檢出率約為10%〔7，8〕。由于目前針對此種疾病缺少敏感的篩查及早期診斷標準，因此研究出關(guān)于胃癌的關(guān)鍵性分析靶點及調(diào)控機制，可從根本上達到防治胃癌。

lncRNA是一種特殊的RNA分子，轉(zhuǎn)錄編碼本大于200個核苷酸，不具有蛋白編碼功能〔9〕。H19是一個編碼2.3 kb的lncRNA，最早被熟知的印記基因之一，對任何蛋白質(zhì)都不進行編碼〔10〕。H19在不同癌癥中表現(xiàn)出的作用不一樣，既是抑癌基因，又是促癌基因〔11〕。在肝癌患者體內(nèi)，H19通過促進miR-200s表達抑制癌細胞的遷移侵襲〔12〕。有研究報道稱，H19與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是胃癌重要的預后分子〔13〕。本研究結(jié)果表明，與癌旁組織相比，H19在胃癌組織中表達水平明顯增加，并且高表達患者預后存活期明顯低于低表達患者，同時H19在胃癌組織中表達水平與腫瘤分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均具有相關(guān)性，與相關(guān)研究報道一致〔14〕。由此可以推測，H19在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，其表達水平影響胃癌預后，有可能成為診斷、治療胃癌潛在的新靶點沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sir)2是一種乙?；福谏矬w中廣泛存在。SIRT6屬于Sir2同源的蛋白質(zhì)家族，但它乙?；富钚苑謭龅?，作用的底物也非常少〔15〕。SIRT6基因定位于人染色體19p13.3，全長8 000 bp以上，包括8個外顯子，編碼的蛋白質(zhì)含有355個氨基酸殘基〔16〕。SIRT6在生命體中的作用非常多，如維持基因穩(wěn)定、延緩細胞衰老、抑制腫瘤等，這些功能可能與SIRT6同時具有的兩種酶活性(去乙酰化酶活性和單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性)相關(guān)。近年來，SIRT6在腫瘤中的作用越來越受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6過表達能夠激活具有激活活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3蛋白的表達，促使肝癌細胞凋亡〔17〕。SIRT6 mRNA和其蛋白在髓母細胞瘤組織中表達出現(xiàn)異常，比癌旁組織顯著下降，推測其可能在髓母細胞瘤中發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中SIRT6表達水平明顯下調(diào)，且SIRT6低表達的患者預后存活期明顯低于高表達患者，與H19表達水平相反，而相關(guān)研究報道稱lncRNA H19對下游基因具有調(diào)控作用〔18〕，這提示胃癌組織中l(wèi)ncRNA H19可能通過某種途徑對SIRT6進行調(diào)控，但是這一關(guān)系需要進一步研究證實。

綜上所述，胃癌患者組織中l(wèi)ncRNA H19表達水平明顯上調(diào)，SIRT6表達水平明顯下調(diào)，且兩者與臨床病理特征及預后關(guān)系十分密切，有望成為診治胃癌的新靶點。但由于此次研究的樣本量較小，lncRNA H19和SIRT6在胃癌中的作用機制還不清，需要進行更加深入研究。