馬娜娜，張心青，楊傳倫，楊丹丹，劉結(jié)磊，王秀芝，曹清杰

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256500；2.博興紅馬飼料科技有限公司，山東濱州 256500）

發(fā)酵飼料主要通過微生物的生長代謝作用或生產(chǎn)代謝過程產(chǎn)生的一些活性物質(zhì)作用于發(fā)酵底料，將其中的大分子物質(zhì)或抗營養(yǎng)因子分解為更易于動物體吸收的小分子物質(zhì)從而提高飼料的利用率［1-3］，同時發(fā)酵飼料中富含的微生物進入動物腸道后能夠增加腸道有益菌群數(shù)量［4］，抑制或降低病原菌數(shù)量，從而提高腸道健康［5，6］。

酵母菌、芽孢桿菌及乳酸菌為最常見的可飼用益生菌［7］。酵母菌體中含豐富的蛋白、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［8］。芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢生命力強，對動物體中的胃液和腸液耐受度高［9］；該菌屬好氧菌，能夠為乳酸菌等厭氧菌提供有利的生長環(huán)境［10］；此外，該菌能夠分泌多種酶物質(zhì)而促進飼料中大分子物質(zhì)被消化［11，12］。乳酸菌發(fā)酵可產(chǎn)生多種有機酸類活性物質(zhì)，對腸道內(nèi)的病原菌有較強的抑殺效果［13］；有研究表明乳酸菌發(fā)酵后期含有較高的超氧化物歧化酶，對動物體的免疫力提高有顯著效果［14］?；炀l(fā)酵就是利用益生菌之間相互作用實現(xiàn)飼料的營養(yǎng)和益生價值最大化。本研究旨在探討混菌發(fā)酵飼料中各益生菌復配比例的最優(yōu)化及其對豬生長性能的影響，研制具有微生物飼料添加劑和發(fā)酵飼料雙重特點的復合益生菌發(fā)酵飼料，為復合益生菌發(fā)酵飼料的生產(chǎn)與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株及動物 飼用菌株：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、EM 酵母、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、納豆芽孢桿菌11083（Bacillus natto）、植物乳桿菌ZP（Lactobacillus plantarum）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida albicans）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

病原菌菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙門氏傷寒菌（Salmonella）。

試驗動物：雄性長白豬，88日齡，體重70～80 kg。

1.1.2 試驗溶劑及培養(yǎng)基 人工胃液［15］：取稀鹽酸（1 mol／L）16.4 mL，加水約800 mL及胃蛋白酶10 g，攪勻后加水定容至1 000 mL，充分溶解后用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

人工腸液［15］：取磷酸二氫鉀6.8 g加水500 mL，用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，另取胰蛋白酶10 g和豬膽鹽3 g加水適量使其溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL，充分溶解后用0.22 pm微孔濾膜過濾除菌。

淀粉培養(yǎng)基：酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基中添加1%的可溶性淀粉。

脫脂奶粉培養(yǎng)基：5 g脫脂奶粉加50 mL蒸餾水溶解，1.5 g瓊脂粉加50 mL蒸餾水溶解，分別高溫高壓滅菌，冷卻后混合倒板。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：稱取25.3 g纖維素剛果紅，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15 min。

發(fā)酵底料：玉米粉∶麩皮∶豆粕 ＝4∶3∶3。

1.2 試驗器材

超凈工作臺VS-840，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司產(chǎn)品；滅菌鍋YXQ-75G，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器SHY-2（THZ-82），常州中捷精密機械有限公司產(chǎn)品；烘箱101-0B，蘇州臺德數(shù)控機械有限公司產(chǎn)品；電子天平FB124，上海齊強儀器制造有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱BJPX，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株篩選 產(chǎn)酸能力評價：無菌條件下用接種環(huán)取固體培養(yǎng)基上的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后進行菌液pH檢測。

菌株耐受能力評價：用檸檬酸鹽緩沖液將益生菌培養(yǎng)液離心制備成菌懸液，吸取0.5 mL分別轉(zhuǎn)接至加有4.5 mL人工胃液或人工腸液的無菌試管中培養(yǎng)，分別取0.5 mL培養(yǎng)1 h和2 h后的培養(yǎng)液進行稀釋涂布，測定活菌數(shù)。

對病原菌的拮抗：取培養(yǎng)12 h的病原菌菌液加入到冷卻至適宜溫度的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻倒板，用打孔器于平板中間打一個孔，加入50 μL益生菌菌液，每個菌3個平行，之后將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，測定抑菌圈大小。

菌株產(chǎn)酶活性檢測：將待測菌液分別滴加到淀粉培養(yǎng)基、脫脂奶粉培養(yǎng)基及纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，觀察是否有透明圈。

1.3.2 混菌復配優(yōu)化 進行菌株的正交設(shè)計試驗，通過檢測分析各組發(fā)酵飼料的指標，篩選最佳復配組合，檢測指標如下。

pH檢測：參照 NY-T 1377—2007［16］。

水分、粗蛋白 檢 測：參 照 GB／T 5915—2008［17］。

乳酸、游離氨基酸含量檢測：將發(fā)酵飼料稀釋10倍后，在搖床勻速振蕩30 min，分別利用乳酸檢測試劑盒、游離氨基酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行乳酸、游離氨基酸含量的檢測。

菌量檢測：準確稱取發(fā)酵飼料1 g加入帶有玻璃珠的無菌鹽水中，搖床振蕩30 min，進行平板稀釋涂布，每個梯度做兩個平行。

1.3.3 飼料發(fā)酵 按量稱取所需物料混合均勻，調(diào)節(jié)水分至35%左右，接種率6%，接種完成后將菌包放置35℃好氧發(fā)酵15～18 h，然后厭氧發(fā)酵4 d。

1.3.4 應用評價 設(shè)置空白組與混菌飼喂組，每組3個重復，每重復2個平行。對照組飼喂全價料，混菌組飼喂10%發(fā)酵飼料＋90%全價料。從試驗第10 d開始取樣，每隔7 d左右取樣一次，檢測豬糞菌量、粗蛋白表觀消化率［18］。試驗結(jié)束進行平均日增重和料肉比的計算。試驗周期2個月。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel和正交設(shè)計助手軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用菌株的篩選

2.1.1 產(chǎn)酸性能檢測 植物乳桿菌ZP、凝結(jié)芽孢桿菌、EM酵母、屎腸球菌及產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)酸能力相對較強，納豆芽孢桿菌11083呈堿性，不具備產(chǎn)酸能力（圖1）。

圖1 發(fā)酵液pH值

2.1.2 抑菌試驗 由表1可知，凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、植物乳桿菌ZP、屎腸球菌及產(chǎn)朊假絲酵母對3株病原菌均具有抑制性，其中凝結(jié)芽孢桿菌和植物乳桿菌ZP對3株病原菌的抑菌效果較優(yōu)。

表1 菌株抑菌圈直徑 （cm）

2.1.3 產(chǎn)酶性能檢測 由表2和圖2可知，納豆芽孢桿菌11083、地衣芽孢桿菌10613、地衣芽孢桿菌11090均具有蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性，綜合比較地衣芽孢桿菌10613的產(chǎn)酶性能優(yōu)于其它菌株。

表2 菌株酶活檢測 （cm）

2.1.4 耐受能力試驗 EM酵母和凝結(jié)芽孢桿菌對人工胃液和人工腸液均具有良好的耐受能力，除屎腸球菌在人工胃液中不耐受外，其它菌株對人工胃液和人工腸液均有一定耐受性（圖3）。

綜上評價結(jié)果，凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌10613 、植物乳桿菌ZP及EM酵母表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，后續(xù)以該4株菌進行混菌復配優(yōu)化試驗。

2.2 混菌復配優(yōu)化

2.2.1 混菌復配正交試驗 根據(jù)各菌株的生長特性及其發(fā)酵飼料的實用性，設(shè)計4因素3水平L9（34）的正交試驗，各因素水平見表3。發(fā)酵結(jié)束后，從外觀看9組發(fā)酵飼料均呈黃色，質(zhì)地均勻，有清香酸味。發(fā)酵飼料總菌量最高為8.81×109cfu／g（表4），總菌量最高組各指標均顯示為最優(yōu)或較優(yōu)，由此可見總菌量與發(fā)酵飼料的品質(zhì)呈正相關(guān)性。以總菌量為依據(jù)進行正交試驗，極差分析顯示各因素對發(fā)酵飼料總菌量的影響為凝結(jié)芽孢桿菌＞植物乳桿菌ZP＞EM酵母＞地衣芽孢桿菌10613（表5）。

表3 混菌復配正交試驗因素水平

2.2.2 正交驗證試驗 根據(jù)正交試驗結(jié)果進行菌株復配，同時將正交試驗中菌量最高組重新驗證，發(fā)酵結(jié)束后進行飼料品質(zhì)評價，結(jié)果見表6。A3B2C2D1組菌量達2.01×1010cfu／g，其它指標也均優(yōu)于A3B3C2D1組，因此，發(fā)酵飼料混菌最佳復配比例為凝結(jié)芽孢桿菌∶植物乳桿菌ZP∶EM酵母∶地衣芽孢桿菌 10613＝6∶2∶2∶1。

表4 混菌復配發(fā)酵結(jié)果

圖2 酶活篩選試驗

圖3 菌株耐受能力試驗結(jié)果

表5 正交試驗結(jié)果分析

表6 正交驗證試驗結(jié)果

2.3 應用評價

2.3.1 豬糞菌量 豬糞中大腸桿菌和益生菌含量的變化趨勢見圖4。大腸桿菌數(shù)量未存在數(shù)量級差異，但飼喂混菌組的大腸桿菌數(shù)量始終低于空白組?；炀M益生菌菌量是空白組的100倍，且后期菌量有所增長，說明飼喂混菌發(fā)酵飼料后能夠提高豬只體內(nèi)的有益菌群數(shù)量，抑制大腸桿菌的繁殖。

圖4 豬糞菌量變化趨勢

2.3.2 飼料粗蛋白表觀消化率檢測結(jié)果 飼喂混菌組對飼料中粗蛋白的表觀消化率優(yōu)于空白組，并呈遞增趨勢，說明發(fā)酵飼料有助于提高豬只對飼料中蛋白的消化吸收（圖5）。

圖5 粗蛋白表觀消化率

2.3.3 平均日增重與料肉比檢測結(jié)果 如表7所示，混菌組6頭豬平均日增重的平均值為1.10 kg／d，空白組6頭豬平均日增重的平均值為0.78 kg／d，混菌組較空白組提高了41.03%?；炀M料肉比的平均值為2.46，空白組料肉比為3.02（表8），混菌組較空白組降低18.54%。表明飼喂混菌發(fā)酵飼料能夠促進豬只的生長，降低飼喂成本。

表7 增重結(jié)果

表8 料肉比結(jié)果

3 討論與結(jié)論

利用益生菌進行混合連續(xù)發(fā)酵，與單菌發(fā)酵相比，可充分發(fā)揮不同菌株間的交互作用，增加飼料中益生菌數(shù)量的同時提高飼料的利用效率［19］。本試驗通過菌株篩選、正交試驗確定最佳混菌復配比例為凝結(jié)芽孢桿菌∶植物乳桿菌ZP∶EM 酵母∶地衣芽孢桿菌 10613＝6∶2∶2∶1?；炀l(fā)酵飼料按照10%的比例加入全價料中進行飼喂，結(jié)果表明混菌發(fā)酵飼料能夠增加豬只體內(nèi)有益菌群數(shù)量，且對大腸桿菌有一定抑制作用；在豬糞有益菌菌量檢測中均能發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料所用的4株菌株，說明其對豬只體內(nèi)的環(huán)境適應性較強；飼喂混菌發(fā)酵料可促進豬只對飼料中粗蛋白的消化吸收，豬只平均日增重較空白組提高41.03%，料肉比降低18.54%。這表明飼喂混菌發(fā)酵飼料能夠明顯促進豬只生長，降低飼喂成本。可見混菌發(fā)酵飼料在動物體防疾病、促生長方面起到積極的作用［20］。