劉坪，董丹，王二強(qiáng)，徐小丹，孟娟娟，侯雋，王仙，吳向未，陳雪玲*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008)

棘球蚴病(echinococcosis)，又稱囊型包蟲病，是一種由棘球絳蟲的幼蟲引起的人畜共患寄生蟲病，肝臟是其常見的發(fā)病部位[1-2]。在感染早期，臨床癥狀不明顯。而在慢性持續(xù)性感染階段，囊腫的體積和數(shù)量增加從而形成占位性病變，可引起組織、器官的物理性損傷。此外，囊腫的破裂會(huì)對(duì)患者的生命和健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，如過(guò)敏性休克等[3]。

固有免疫系統(tǒng)在識(shí)別入侵的病原微生物，抵抗人類寄生蟲并啟動(dòng)適應(yīng)性免疫過(guò)程中至關(guān)重要[4]。固有免疫細(xì)胞表達(dá)多種模式識(shí)別受體(PRR)，其中Toll樣受體(TLR)是非常重要的一種，TLR幾乎表達(dá)于所有免疫細(xì)胞，包括肝細(xì)胞，通過(guò)感知多種病原體(如蠕蟲)并誘導(dǎo)獲得性免疫在先天免疫中起重要作用從而參與了原生動(dòng)物寄生蟲的第一道防線[4-5]。TLR2作為識(shí)別病原體重要的一員，研究表明激活TLR1/2信號(hào)傳導(dǎo)可以激活免疫反應(yīng)，而TLR2/6信號(hào)的激活可以抑制T細(xì)胞免疫[6]。為了解囊型包蟲病感染過(guò)程中TLR2的表達(dá)情況及其對(duì)免疫反應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建繼發(fā)型小鼠肝細(xì)粒棘球蚴感染模型，于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝臟TLR2的表達(dá)水平，以及肝臟的病理改變，探討TLR2與肝臟炎癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康的雌性C57BL/6小鼠40只，周齡6～8周，體重(20±2) g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(A2017-068-01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、蘇木素、伊紅(Solarbio公司)，胎牛血清(FBS)(BI公司)，TLR2抗體(Abcam公司)，HRP(中山金橋公司)，TLR2引物(上海生工公司)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司)，熒光染料(SYBR Green I)(康維公司)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR儀(BioRad生物工程公司)。

1.3 目的及內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)按照 GeneBank小鼠TLR2基因序列，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物均由上海生工公司合成，基因序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4 原頭蚴采集和培養(yǎng)

從屠宰場(chǎng)采集新鮮自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊肝臟，用75%酒精消毒，然后以50 mL注射器無(wú)菌方式抽取完整的包囊內(nèi)容物(囊液清澈)置于無(wú)菌瓶中，待原頭蚴自然沉淀后，用含1%雙抗(100 μ·mL-1青霉素和鏈霉素)的無(wú)菌PBS清洗3～5次，加入1640(含8%FBS，1%雙抗)培養(yǎng)液至于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.5 小鼠肝細(xì)粒棘球蚴感染模型建立

將40只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組20只，實(shí)驗(yàn)組20只。實(shí)驗(yàn)組小鼠10%水合氯醛麻醉后，逐層開腹暴露肝臟(在剪開最后一層腹膜時(shí)，選取無(wú)血管無(wú)肌肉的最薄處剪開腹膜)，將含5 000個(gè)原頭蚴(活性>90%)的懸液0.1 mL注入肝被膜下。對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS液。術(shù)后置于保溫箱恢復(fù)體溫，常規(guī)飼養(yǎng)，第3、7、14、21 d各隨機(jī)取5只小鼠，頸椎脫臼處死后，無(wú)菌條件下解剖小鼠。每只小鼠根據(jù)病灶和病灶近旁采集肝組織2份，一份用于病理組織染色，一份用于肝組織RNA檢測(cè)(-80 ℃?zhèn)溆?，評(píng)價(jià)以下指標(biāo)：

小鼠一般情況：包括精神狀態(tài)、毛發(fā)、飲食、活動(dòng)、死亡等情況。

肝組織情況：(1)肉眼觀察肝組織形態(tài)、顏色、腫物變化等；(2)HE染色：用4%多聚甲醛固定肝組織，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，梯度酒精脫水、二甲苯透明，蘇木素、伊紅染色后顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)肝組織中TLR2水平

Trizol法提取肝組織(重量一致)總RNA，并測(cè)定總RNA濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成20 μL體系的cDNA(逆轉(zhuǎn)錄時(shí)根據(jù)濃度調(diào)整加入RNA體積，以保證加入的總RNA含量一致)。qRT-PCR的反應(yīng)體系：12.5 μL SYBR Green Ⅰ，上下游引物共1 μL，cDNA 1 μL，無(wú)酶水10.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參照，采用2-△△ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 免疫組化檢測(cè)肝組織中TLR2表達(dá)

肝組織經(jīng)常規(guī)固定、包埋、切片、脫水處理等。加一抗、二抗孵育。由研究者及1名病理科醫(yī)師釆用人工雙盲法分別閱片評(píng)分。在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野進(jìn)行觀察，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞(著色呈棕色細(xì)顆粒狀)百分比進(jìn)行評(píng)分：1%～10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。對(duì)染色強(qiáng)度評(píng)分：凡細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核不著色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。評(píng)分結(jié)果由上述2項(xiàng)指標(biāo)的兩積分相乘分為4級(jí)：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽(yáng)性(+)；5～8分為中等陽(yáng)性(++)；9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化染色數(shù)據(jù)分析，采用wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠一般情況

對(duì)照組小鼠一般情況正常，均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；模型組小鼠一般生長(zhǎng)情況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等良好，且感染率100%，零死亡(表2)。

表2 兩組小鼠一般情況

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠肝臟組織形態(tài)變化

對(duì)照組肝組織形態(tài)完整，色澤深紅，表面光滑，光鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列整齊、肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)變性壞死(圖1A，圖2A)。模型組在感染后第3天，肝組織表面可見細(xì)小白點(diǎn)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織表面的白色囊型物增大，在第14天、第21天明顯可見白色囊型物凸出肝臟表面(圖1B-E)，光鏡下可見感染后第3天肝臟中圍繞肝小葉周邊可見輕度水樣變性，少量異物樣巨細(xì)胞及慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第7天可見肉芽腫樣改變，周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有增生的纖維組織包繞；第14天可見肉芽腫伴大量異物樣巨細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞明顯增多，見囊樣結(jié)構(gòu)形成；第21天可見肉芽腫改變，纖維組織增生明顯，少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B-E)。

圖1 不同天數(shù)小鼠肝組織形態(tài)

圖2 不同天數(shù)肝組織HE染色(200×)

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠肝組織中TLR2的表達(dá)(圖3、表4)

圖3 不同天數(shù)兩組小鼠肝組織TLR2mRNA表達(dá)水平(*P<0.05)

表4 不同天數(shù)兩組小鼠肝組織TLR2蛋白質(zhì)表達(dá)情況 %

qRT-PCR結(jié)果顯示：小鼠感染細(xì)粒棘球蚴后肝臟中TLR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在第3、14、21 d均顯著高于對(duì)照組，Z值及P值分別為：Z=-2.087，P=0.037；Z=-2.087，P=0.037；Z=-2.087，P=0.037，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)(圖3)。免疫組化結(jié)果顯示：在3、7、14、21 d，模型組病灶處TLR2蛋白質(zhì)表達(dá)高于對(duì)照組，Z值及P值分別為：Z=-2.023，P=0.043；Z=-2.023，P=0.043；Z=-2.023，P=0.043，Z=-2.121，P=0.034，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)(表4，圖4)。

圖4 不同天數(shù)兩組小鼠肝組織TLR2蛋白質(zhì)表達(dá)(200×)

3 討論

本研究通過(guò)開腹直視下肝臟(肝被膜)注射原頭蚴的方法構(gòu)建C57BL/6 J小鼠繼發(fā)囊型包蟲病模型，發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴寄生于中間宿主后，均定植在肝組織，感染率100%，創(chuàng)傷小，易于操作；而傳統(tǒng)的腹腔接種法雖然易于操作，但是感染后形成的包囊往往分布在腹腔內(nèi)各個(gè)器官，定植在肝臟的幾率比較小(僅20.5%)，門靜脈注射法感染率高達(dá)93.1%，但小鼠的門靜脈較細(xì)，穿刺注射原頭蚴時(shí)易引起大出血[7-8]。同時(shí)，感染后模型組小鼠肝臟表面可見大小不等的白點(diǎn)，隨著感染時(shí)間的推移，在14、21 d時(shí)明顯可見白色囊型物(包蟲囊腫)凸出于肝臟表面；光鏡下觀察，早期感染組小鼠肝組織病灶周圍有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組嚴(yán)重，后期隨著蟲體不斷增大，21 d可見肉芽腫發(fā)生，且纖維化也不斷增加，表明細(xì)粒棘球蚴感染后，首先發(fā)生了異物反應(yīng)，在肝臟引起損傷和炎性反應(yīng)，這與包蟲病患者肝組織結(jié)果一致[9]。

TLR2通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式和內(nèi)源性分子，調(diào)節(jié)各種免疫和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)，啟動(dòng)針對(duì)病原體的早期應(yīng)答，誘發(fā)獲得性免疫反應(yīng)[10]。在非酒精性脂肪性肝炎模型中，TLR2-/-小鼠的肝細(xì)胞比野生型小鼠損傷更為嚴(yán)重[11]。TLR2在感染剛地弓形蟲小鼠肝組織中明顯過(guò)表達(dá)，同時(shí)肝臟病理嚴(yán)重程度隨時(shí)間增加[12]。與野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠感染日本血吸蟲尾蚴后,小鼠肝臟肉芽腫大小和纖維化程度顯著降低[13-14]，而TLR2-/-小鼠感染利什曼原蟲前鞭毛體第4周，肝臟炎癥面積較小[15]。本研究顯示，模型組的TLR2 mRNA及蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量增高，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)呈升高趨勢(shì)，提示TLR2陽(yáng)性表達(dá)的肝組織處于炎性反應(yīng)期，這與其他寄生蟲感染研究相似。由此，我們推測(cè)宿主感染細(xì)粒棘球蚴造成損傷，反應(yīng)性地引起被感染的肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，可能與細(xì)粒棘球蚴感染后TLR2的高表達(dá)有關(guān)。日本血吸蟲蟲卵的分泌物通過(guò)TLR2- MyD88/MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化調(diào)節(jié)肝組織病理變化[13]，那么細(xì)粒棘球蚴感染是否具有類似的分子機(jī)制，經(jīng)病理醫(yī)師對(duì)連續(xù)切片(HE及免疫組化染色)進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)TLR2主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞，本課題組將采用Western blot的方法完善肝組織TLR2蛋白水平表達(dá)變化，并獲取肝臟巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞)，檢測(cè)TLR2及其下游信號(hào)蛋白表達(dá)情況，完善細(xì)粒棘球蚴感染后TLR2作用的機(jī)制研究。

綜上所述，TLR2 mRNA及蛋白質(zhì)高表達(dá)于細(xì)粒棘球蚴感染的小鼠肝組織，對(duì)小鼠肝臟炎性損害有一定影響，可能參與調(diào)節(jié)肝組織病理變化，有助于細(xì)粒棘球蚴在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存，也將為研究囊型肝包蟲病的致病機(jī)理提出新思路。