郭 平，徐富凱，劉亦博，李美璇，封保根，3，陳薇薇

(1. 吉林大學(xué) 新能源與環(huán)境學(xué)院，地下水資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130012；2. 吉林省水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130021；3. 中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)有限公司 流域樞紐運(yùn)行管理中心，湖北 宜昌 443000)

隨著工業(yè)化和城鎮(zhèn)化的快速推進(jìn), 我國(guó)現(xiàn)在面臨嚴(yán)重的土壤污染問(wèn)題, 而重金屬污染是土壤污染中最重要的一方面[1]，其中砷(As)是最常見(jiàn)的重金屬污染物之一[2]. 近年來(lái), As污染土壤的植物與微生物聯(lián)合修復(fù), 因其具有生態(tài)友好性、 修復(fù)面積大以及成本低等優(yōu)點(diǎn)已成為土壤污染修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). 因此, 揭示其修復(fù)機(jī)制具有實(shí)際意義.

無(wú)機(jī)砷酸鹽[As(Ⅴ)]和亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]是土壤中分布最廣的As化合物[3]. 將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)可提高As的生物有效性, 有效促進(jìn)植物對(duì)As的吸收富集[4]. 因此，研究人員將能還原As(Ⅴ)的外源砷酸還原菌(ARB)與As超積累植物或As富集植物聯(lián)合修復(fù)As污染土壤, 結(jié)果表明，外源砷酸還原菌可提高As超積累植物或者As富集植物對(duì)土壤As的修復(fù)效果[5-8]. 植物根系分泌物是根際環(huán)境中的重要物質(zhì), 其成分包括有機(jī)酸、 氨基酸、 糖類等[9]. 由于植物根系分泌物能影響土著根際細(xì)菌以及部分外源降解菌的存活[10-11]，因此，在As污染土壤的植物-微生物修復(fù)中, 外源ARB的存活也應(yīng)受根系分泌物的影響. 但目前關(guān)于根系分泌物對(duì)外源ARB存活影響的信息較少, 而且在根系分泌物存在的情形下, ARB對(duì)As(Ⅴ)還原能力的影響仍未知. 此外, 酶活性可反映土壤肥力和土壤環(huán)境, 對(duì)植物-微生物修復(fù)的效果也有重要影響. 目前關(guān)于外源ARB對(duì)土壤酶活性影響的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少. 根系分泌物存在下ARB的存活特征及其對(duì)As(Ⅴ)還原能力和土壤酶活性的影響是研究植物與外源ARB聯(lián)合修復(fù)As污染土壤的重要機(jī)制.

基于此, 本文以砷酸還原菌(Stenotrophomonassp.TS28)以及油菜、 小麥和小白菜產(chǎn)生的根系分泌物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 研究根系分泌物對(duì)As污染土壤中砷酸還原菌TS28存活、 As還原能力的影響以及土壤酶活性的變化規(guī)律，為植物與微生物聯(lián)合修復(fù)As污染土壤提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 供試土壤的采集與制備

實(shí)驗(yàn)土壤取自吉林省某處農(nóng)田未受As污染的表層(0～20 cm)黑土(記為NAs), 自然風(fēng)干、 粉碎過(guò)2 mm篩網(wǎng)后儲(chǔ)藏備用. 實(shí)驗(yàn)土壤的基本理化性質(zhì)列于表1. 在實(shí)驗(yàn)土壤中加入砷酸鈉溶液, 得到50 mg/kg的As污染土壤(記為As), 自然老化3個(gè)月, 風(fēng)干, 粉碎過(guò)2 mm篩網(wǎng)后儲(chǔ)藏備用.

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical-chemical characteristics of test soils

1.2 根系分泌物的提取

油菜、 小麥和小白菜種子購(gòu)自吉林省農(nóng)科院種子站, 表面消毒后在潮濕條件下萌發(fā). 按文獻(xiàn)[12-14]方法從土壤中取出試管苗收集根系分泌物. 將收集的根系分泌物過(guò)0.45 μm濾膜, 過(guò)濾滅菌, 于-4 ℃儲(chǔ)存. 用總有機(jī)碳分析儀(TOC-5050A型, 日本島津公司)測(cè)定過(guò)濾后根系分泌物的質(zhì)量濃度(以總有機(jī)碳質(zhì)量濃度標(biāo)定), 油菜、 小麥和小白菜根系分泌物的質(zhì)量濃度分別為39.16,30.57,27.98 mg/L. 根據(jù)油菜根系分泌物的質(zhì)量濃度確定本文中根系分泌物的研究質(zhì)量濃度為39.16 mg/L[15].

1.3 菌株的標(biāo)記與培養(yǎng)

選擇實(shí)驗(yàn)菌株為具有As還原能力的細(xì)菌Stenotrophomonassp.TS28(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王革嬌教授惠贈(zèng)). 將保存在-70 ℃的細(xì)菌接種到3 mL LB液體培養(yǎng)基(酵母膏5 g/L, 胰蛋白胨10 g/L, 氯化鈉5 g/L)中, 先在28 ℃, 250 r/min條件下培養(yǎng)25 h, 再在LB固體培養(yǎng)基中用0.1 g/L的利福平標(biāo)記細(xì)菌[16]. 結(jié)果表明, 實(shí)驗(yàn)土壤中除TS28外的細(xì)菌不能在含0.1 g/L利福平的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng), 即計(jì)算的菌落形成單位(CFU)均來(lái)源于標(biāo)記的TS28. 同時(shí), 標(biāo)記菌的生長(zhǎng)曲線和對(duì)As(Ⅴ)的還原能力保持不變. 將標(biāo)記細(xì)菌接種到液體培養(yǎng)基中, 用去離子水稀釋, 制得接種劑(107CFU/mL, OD600nm=1).

1.4 細(xì)菌存活和As還原

分別將100 g的NAs和As土添加到塑料盆中, 每盆土壤按107CFU/g濃度接種, 標(biāo)記為TS28, 實(shí)驗(yàn)期間每盆土壤接種1次. 接種結(jié)束后, 為模擬根系分泌物的持續(xù)釋放, 每天添加根系分泌物至質(zhì)量濃度為39.16 mg/kg, 共持續(xù)10 d. 將塑料盆轉(zhuǎn)移到25 ℃、 相對(duì)濕度為70%的恒溫培養(yǎng)箱中. 每24 h稱取2份2 g土壤樣品, 將1份土壤樣品與5.0 mL,w=0.1%的蛋白胨緩沖液充分混合, 渦旋20 s, 2次，用含有利福平的LB培養(yǎng)基進(jìn)行涂板和菌落計(jì)數(shù). 從另一份土壤樣品中提取As(Ⅲ)和As(Ⅴ), 用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法 (HPLC-HG-AFS, AFS-2202E型，北京海光儀器有限公司)分析測(cè)定[17]. 每種處理重復(fù)3次.

1.5 土壤酶活性測(cè)定

測(cè)定處理1，4，8 d土壤中酶的活性. 用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶活性[18]; 用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定酸性磷酸酶活性[19]; 用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖酶活性[20]; 用對(duì)硝基苯磷酸二鈉法測(cè)定脫氫酶活性[19].

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)菌存活數(shù)量的下降率可表示細(xì)菌在一段時(shí)間內(nèi)的存活狀態(tài)變化, 通過(guò)計(jì)算TS28存活數(shù)量的下降率分析其在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的存活能力. 下降率(η)的計(jì)算公式為

(1)

式中Nt為第t天的菌數(shù),Nt+1為第(t+1)天的菌數(shù).

lg(Nt/N0)=-(t/δ)p，

(2)

式中:t為培養(yǎng)時(shí)間(d);N0和Nt分別為0時(shí)刻和t時(shí)刻時(shí)的種群密度(CFU/mL);δ為細(xì)菌數(shù)第一次下降10倍所需時(shí)間;p為形狀參數(shù),p<1生存曲線上凸,p>1生存曲線下凹,p=1表示線性生存曲線.

用SPSS軟件IBM SPSS Statistics 22.0處理數(shù)據(jù), 所有圖形均用Origin 2019軟件繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 根系分泌物對(duì)As污染土壤中TS28存活的影響

圖1為As污染土壤中添加油菜、 小麥以及小白菜根系分泌物對(duì)砷酸還原菌TS28存活數(shù)量的影響. 由圖1可見(jiàn), 無(wú)論是否存在As污染, 砷酸還原菌TS28的存活量均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì). 與對(duì)照土壤相比, As污染土壤中TS28的存活數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)下降更快, 且二者呈顯著差異(P<0.05). 在第7天的As污染土壤中，TS28的存活量相比對(duì)照土壤降低了38.64%，與文獻(xiàn)[21-22]結(jié)果相似, 表明土壤中的As抑制了TS28的存活. 這是因?yàn)锳s(Ⅴ)作為一種磷酸鹽類似物, 可取代影響三磷酸腺苷(ATP)合成的無(wú)機(jī)磷, 從而干擾能量的產(chǎn)生、 碳代謝以及核酸合成, 進(jìn)而抑制了細(xì)菌的存活, 導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量顯著下降[23].

圖1 根系分泌物存在下As污染 土壤中TS28的存活曲線Fig.1 Survival curves of TS28 in As contaminated soil in presence of root exudates

不同處理方法下As污染土壤中TS28的生存曲線擬合參數(shù)列于表2. 由表2可見(jiàn), 添加不同根系分泌物后As污染土壤中TS28的δ=0.39～1.31. 表明在As污染土壤中添加不同根系分泌物導(dǎo)致TS28存活量降低一個(gè)數(shù)量級(jí)所用的時(shí)間不同, 可見(jiàn)不同根系分泌物對(duì)TS28存活的影響不同. 在根系分泌物存在下，TS28的p=0.60～1.06, 與As污染土壤存在差別. 表明添加根系分泌物后, As污染土壤中TS28存活曲線形狀發(fā)生了較大改變. 添加根系分泌物后，TS28的存活時(shí)間為5.88～6.16 d, 均高于As污染土壤. 表明3種根系分泌物均可延長(zhǎng)TS28的存活時(shí)間, 且3種根系分泌物對(duì)TS28存活時(shí)間的延長(zhǎng)效果相差較小.

由表2和圖1可見(jiàn), 添加植物根系分泌物可刺激TS28的活性, 顯著提高TS28在As污染土壤中的存活數(shù)量并延長(zhǎng)其存活時(shí)間. 在第7天的As污染土壤中, 添加油菜、 小麥以及小白菜根系分泌物的TS28存活量分別是未添加根系分泌物的246.41%，285.74%，286.17%, 存活時(shí)間分別延長(zhǎng)了29.23%，34.95%，35.38%. 主要是因?yàn)橹参锔捣置谖镏泻写罅康挠袡C(jī)成分, 可為細(xì)菌提供必要和豐富的營(yíng)養(yǎng)[24], 從而提高了TS28數(shù)量. 由于初始細(xì)菌數(shù)會(huì)影響細(xì)菌存活率[25], 因此TS28存活數(shù)量的下降率可用于評(píng)估細(xì)菌存活能力隨培養(yǎng)時(shí)間的變化. 經(jīng)計(jì)算, 在As污染土壤中添加油菜、 小麥和小白菜根系分泌物后, TS28的平均下降率分別為3.08%，3.00%，3.00%, 均低于不含根系分泌物As污染土壤中4.49%的下降率，且小白菜和小麥的根系分泌物比油菜的根系分泌物對(duì)TS28的活性有更強(qiáng)的促進(jìn)作用.

表2 不同處理方法下As污染土壤中TS28的生存曲線擬合參數(shù)Table 2 Survival curve fitting parameters of TS28 in As contaminated soil under different treatments

2.2 根系分泌物對(duì)As污染土壤中As(Ⅴ)還原的影響

在As污染土壤中, 3種植物根系分泌物對(duì)TS28還原As(Ⅴ)的影響如圖2所示. 由圖2可見(jiàn)，在未添加TS28和根系分泌物的情形下, 土壤中的As(Ⅴ)在10 d內(nèi)未被還原, 表明As污染土壤中的物質(zhì)和微生物不能還原As(Ⅴ). 在添加TS28的As污染土壤中, As(Ⅲ)在土壤中的積累量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢(shì). 前4 d, As(Ⅲ)的積累量達(dá) 8.84 mg/kg, 10 d內(nèi)As(Ⅲ)的總積累量達(dá)10.03 mg/kg, 前4 d的還原量占總還原量的88.14%, 表明TS28可有效還原As(Ⅴ), 且As(Ⅴ)的還原主要發(fā)生在實(shí)驗(yàn)前期. 這是由于實(shí)驗(yàn)前期土壤中的TS28存活數(shù)量較大, 土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多, 因此TS28對(duì)As(Ⅴ)的還原能力較強(qiáng).

圖2 根系分泌物存在下TS28對(duì)As(Ⅴ)還原的影響Fig.2 Effects of TS28 on As(Ⅴ) reduction in presence of root exudates

2.3 根系分泌物對(duì)As污染土壤中酶活性的影響

土壤酶是土壤中最活躍的有機(jī)成分之一, 代表土壤物質(zhì)旺盛的能量代謝, 是與土壤肥力和生態(tài)環(huán)境質(zhì)量相關(guān)的重要生物學(xué)指標(biāo)[28]. 根系分泌物和TS28對(duì)土壤中酶活性的影響如圖3所示. 由圖3可見(jiàn), 與未受As污染土壤相比, 無(wú)論是否添加TS28或根系分泌物, As污染土壤中的脲酶、 脫氫酶、 磷酸酶和蔗糖酶的活性均隨時(shí)間延長(zhǎng)而迅速下降, 表明As降低了土壤酶活性. 在僅含As污染土壤的處理組中，8 d內(nèi)4種土壤酶活性分別下降67.42%，36.58%，32.62%，39.43%. 這可能是由于As與酶-底物復(fù)合物相互作用[29], 使酶蛋白變性或與蛋白活性基團(tuán)相互作用降低了酶活性所致.

a. As純土壤； b. As+TS28； c. As+小白菜； d. As+小麥； e. As+油菜； f. As+TS28+小白菜； g. As+TS28+小麥； h. As+TS28+油菜； i. NAs純土壤； j. NAS+TS28； k. NAs+小白菜； l. NAs+小麥； m. NAs+油菜； n. NAs+TS28+小白菜； o. NAs+TS28+小麥； p. NAs+TS28+油菜. 圖3 根系分泌物和TS28對(duì)土壤中酶活性的影響Fig.3 Effects of root exudates and TS28 on enzyme activities in soil

TS28處理使土壤中蔗糖酶和脫氫酶活性下降, 相比于As土壤組, 土壤中蔗糖酶和脫氫酶活性在第8天分別下降27.67%，13.23%, 對(duì)其他土壤酶活性影響較小. 生物體內(nèi)的大多數(shù)氧化還原反應(yīng)是由氧化還原酶(如脫氫酶)催化的. 添加TS28削弱了可能產(chǎn)生脫氫酶和蔗糖酶的細(xì)菌的存活優(yōu)勢(shì), 從而抑制了這兩種酶的活性. 此外, TS28對(duì)As(Ⅲ)的積累可能增強(qiáng)了As對(duì)微生物的毒害作用, 進(jìn)而抑制了這兩種酶的活性.

根系分泌物可緩解TS28和As對(duì)土壤酶的抑制, 增強(qiáng)酶活性. 與TS28處理組相比, 含有根系分泌物和TS28處理組的脲酶、 酸性磷酸酶、 蔗糖酶和脫氫酶的活性明顯升高，其中油菜根系分泌物增強(qiáng)土壤酶活性的效果最好. 這主要是由于脲酶、 酸性磷酸酶和蔗糖酶是參與土壤中碳、 氮、 磷養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的幾種主要酶[29], 而含有這些營(yíng)養(yǎng)素的根系分泌物可誘導(dǎo)微生物更多地產(chǎn)生和釋放這3種酶. 同時(shí), 在土壤中對(duì)As脅迫耐性較強(qiáng)的細(xì)菌可能具有更強(qiáng)的利用碳、 氮、 磷養(yǎng)分的酶系統(tǒng), 根系分泌物可刺激這些細(xì)菌分泌更多的酶抵抗脅迫. 此外, 由于脫氫酶在生物體內(nèi)的能量供應(yīng)中起重要作用, 因此, 根系分泌物可誘導(dǎo)生成脫氫酶的細(xì)菌產(chǎn)生更多的脫氫酶以抵抗As的脅迫. 根系分泌物中的有機(jī)碳可提高酶的抗分解能力和穩(wěn)定性[9], 這可能也是根系分泌物提高脫氫酶活性的原因.

綜上, 根系分泌物、 TS28和As對(duì)土壤酶活性的影響因酶的類型不同而不同. 土壤中酶的活性是土壤微生物、 pH、 有機(jī)質(zhì)、 營(yíng)養(yǎng)元素、 重金屬等多種因素綜合作用的結(jié)果.

3 結(jié) 論

1) 油菜、 小麥和小白菜的根系分泌物改變了TS28的存活模式, 可促進(jìn)TS28的活性，其中小白菜根系分泌物對(duì)TS28活性有更強(qiáng)的促進(jìn)作用.

2) 3種根系分泌物對(duì)TS28還原As(Ⅴ)能力的影響不同： 油菜根系分泌物前期促進(jìn)了TS28對(duì)As(Ⅴ)的還原； 小麥和小白菜的根系分泌物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均不同程度地促進(jìn)了As(Ⅴ)的還原； 3種根系分泌物中, 小麥根系分泌物的促進(jìn)作用更強(qiáng).

3) TS28降低了As污染土壤中蔗糖酶和脫氫酶的活性, 而對(duì)脲酶和磷酸酶活性幾乎無(wú)影響； 添加根系分泌物提高了含TS28的As污染土壤中4種酶的活性, 其中油菜根系分泌物的促進(jìn)效果最好.