劉 鍵，劉 昕

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫研究所，北京 100176； 2.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124)

病毒是造成全球范圍內(nèi)疾病發(fā)病率和死亡率居高不下的最主要的病原體，由于病毒的大小在納米級(jí)，不便直接觀察到其形狀以及研究它們的結(jié)構(gòu).同時(shí)，病毒的結(jié)構(gòu)相當(dāng)簡(jiǎn)單，通常只有蛋白質(zhì)衣殼及核酸內(nèi)核，這種結(jié)構(gòu)使病毒能隨著環(huán)境變化通過基因替換或基因重組等方式發(fā)生快速的突變和進(jìn)化，從而逃避免疫監(jiān)測(cè)或免疫抑制，增大病愈難度.因此，發(fā)展快速、高效的病毒檢測(cè)方法，是當(dāng)前迫切的社會(huì)需求，也始終是科研工作者不斷研究探索的方向.

目前，常用的病毒檢測(cè)方法有病原體培養(yǎng)、核酸檢測(cè)、免疫學(xué)方法等.病原體分離培養(yǎng)和核酸檢測(cè)都需要專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員且技術(shù)繁雜.免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫熒光、膠體金免疫層析等，其中膠體金免疫層析技術(shù)快捷方便，非常適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但其靈敏度低.

2007年，中國(guó)科學(xué)院閻錫蘊(yùn)院士發(fā)現(xiàn)了納米磁顆粒具有辣根過氧化物酶活性，能使辣根過氧化物酶底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethyl benzidine，TMB)、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)、2,2′-二氨基聯(lián)苯胺(2,2′-diaminobenzidine，DAB)變色，增加其檢測(cè)靈敏度，從而展開了納米酶學(xué)的研究.隨著納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究及納米酶學(xué)的發(fā)展，納米酶所具有的內(nèi)在酶活性、獨(dú)特的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)勢(shì)，逐漸發(fā)展為替代天然酶的最佳選擇，基于納米酶的病毒檢測(cè)方法也吸引了大量科學(xué)家進(jìn)行探索和研究.

1 病毒概述

病毒是造成全球范圍內(nèi)疾病發(fā)病率和死亡率居高不下的最主要的病原體.艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)在全球的蔓延，始終沒有放慢腳步，對(duì)人類造成巨大的損失；2003年，在中國(guó)橫行肆虐的重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS) 令全世界人民心有余悸，從中國(guó)廣東省開始，SARS病毒在短短5個(gè)月里傳播到世界上30個(gè)國(guó)家和地區(qū)，截至2003年7月5日，全球有8 439人受到感染，812人死于SARS[1]；1997年在中國(guó)香港首次發(fā)現(xiàn)人感染禽流感病毒H5N1病例[2]，死者是個(gè)3歲男孩，在那次病毒爆發(fā)中，共有18個(gè)人受到傳染，6人死亡；2013年首次在中國(guó)安徽省發(fā)現(xiàn)的H7N9[3]，截至2015年1月10日,全國(guó)已確診134人，37人死亡，2018年H7N9的死亡率達(dá)到38%[4]；寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)最早于1947年首次分離于非洲恒河猴，2015年引起南美洲和加勒比地區(qū)發(fā)生大規(guī)模疾病爆發(fā)，寨卡病毒感染能引起一些嚴(yán)重的潛在并發(fā)癥，如新生兒小頭癥和格林巴利綜合癥，因此引起了社會(huì)的恐慌和全球的廣泛關(guān)注[5]，2016年中國(guó)確診了一例ZIKV輸入性感染病例；中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)首次于2012年從沙特阿拉伯2名病人體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀與SARS相似，所以也稱為“類SARS-CoV病毒”，從2012年6月到2015年4月20日期間沙特阿拉伯病感染人數(shù)達(dá)到981例，死亡率高達(dá)43.6%[6]；2014年，源自西非的埃博拉病毒(Ebola virus，EBoV)引起大規(guī)模疾病爆發(fā)，截止到2015年4月14日，超過25 515人感染，10 572人死亡[7].這些病毒都對(duì)人類的生命財(cái)產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅.

由于病毒的大小在納米級(jí)(20～900 nm)，相對(duì)于其他病原體，例如細(xì)菌或真菌這些在光學(xué)顯微鏡下就能觀察到的致病菌來說，只有在放大倍數(shù)達(dá)到10萬倍以上的電子顯微鏡，才能直接觀察到病毒的形狀，研究它們的結(jié)構(gòu).這使得病毒更加難以觀察、檢測(cè)和分離.

同時(shí)，病毒的結(jié)構(gòu)相當(dāng)簡(jiǎn)單，通常只有蛋白質(zhì)衣殼及核酸內(nèi)核，這種簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)使病毒能隨著環(huán)境變化通過基因替換或基因重組等方式發(fā)生快速的突變和進(jìn)化，使人類很難建立簡(jiǎn)便、長(zhǎng)效、普適的體系進(jìn)行病毒檢測(cè).

除了病毒自身基因突變和進(jìn)化外，人類活動(dòng)和生物遷徙等因素也會(huì)促使感染的傳播.隨著全球一體化程度的不斷深入，人群的流動(dòng)性大大增加，病毒感染引發(fā)的大規(guī)模傳染病在人群中迅速擴(kuò)散，造成巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和財(cái)產(chǎn)損失[8].

病毒感染后，有時(shí)會(huì)因?yàn)榕R床表現(xiàn)不明確，病人常被誤診.快速有效的病毒檢測(cè)方法，可以明確感染是否發(fā)生以及感染病毒的類型，不僅為臨床盡早針對(duì)病因用藥和制定準(zhǔn)確的治療方案提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且可以立即采取公共衛(wèi)生防控措施，及時(shí)限制它們的傳播.

采用針對(duì)性強(qiáng)的診斷工具，發(fā)展快速、高效的病毒檢測(cè)方法，對(duì)疾病的診斷治療和公共衛(wèi)生的監(jiān)測(cè)都非常重要，是當(dāng)前迫切需要解決的社會(huì)問題.新的檢測(cè)方法的不斷探索，也是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一.

2 病毒傳統(tǒng)檢測(cè)方法

2.1 病原體分離培養(yǎng)法

傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法是直接從病體血液、組織或分泌物中分離出病毒，接下來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)，通過觀察病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)來量化感染病毒，通過檢測(cè)半數(shù)組織細(xì)胞感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)衡量病毒滴度，這是證實(shí)病毒感染的準(zhǔn)確指標(biāo)，也是病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”.

病原體分離培養(yǎng)法的關(guān)鍵點(diǎn)就是選擇適合病毒體外培養(yǎng)的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件，這些并不容易獲得，而且不是所有病毒都可以培養(yǎng)，例如：諾如病毒(Norovirus)[9]以及乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)[10]就不能通過現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室的任何宿主細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，因此應(yīng)用范圍較為局限.同時(shí)，分離培養(yǎng)法耗時(shí)、耗力、實(shí)驗(yàn)花費(fèi)大[11]，這些缺點(diǎn)都與當(dāng)前發(fā)展快速、便捷的檢測(cè)方法不相適應(yīng).

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)

免疫系統(tǒng)具有識(shí)別外來抗原性異物的功能，病毒作為外來入侵的抗原，入侵人體后能被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別，并產(chǎn)生特異性抗體.病毒血清學(xué)檢測(cè)就是利用抗原抗體特異性識(shí)別和結(jié)合的原理檢測(cè)病毒及其抗體的技術(shù).血清學(xué)檢測(cè)常用方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、免疫熒光方法、免疫印跡方法以及免疫層析試驗(yàn)等.

這些技術(shù)的主要原理都是利用特異性抗體與酶、放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或者熒光物質(zhì)這樣的信號(hào)報(bào)告系統(tǒng)相結(jié)合，產(chǎn)生底物復(fù)合物后經(jīng)酶的作用發(fā)生顏色變化或者發(fā)出熒光、放射線等，來反映和指示病毒是否存在[8].這些方法不需要分離出病毒，操作相對(duì)方便，很多試劑也已經(jīng)商品化.但是像腸道病毒、鼻病毒這樣具有廣泛的抗原異質(zhì)性、缺乏交叉反應(yīng)抗原的病毒，血清檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性就受到很大挑戰(zhàn)，假陽(yáng)性率較高[12].

在這些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，膠體金免疫層析技術(shù)最為快速簡(jiǎn)便，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但其靈敏度較低的缺點(diǎn)限制了其廣泛推廣.

2.3 核酸檢測(cè)

1985年，核酸擴(kuò)增——聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的發(fā)展和應(yīng)用[13],使得病毒檢測(cè)拓展到可直接檢測(cè)病毒的遺傳物質(zhì)，基于 PCR 技術(shù)開展病原體檢測(cè)的方法也得到廣泛應(yīng)用，陸續(xù)發(fā)展起來的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)、核酸雜交、基因芯片等方法，更是大大加速了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)事業(yè)的發(fā)展.但檢測(cè)核酸的方法雖然靈敏度相對(duì)較高，但也存在一些弊端，如需要專業(yè)的技術(shù)人員操作，設(shè)備昂貴，需要特殊的實(shí)驗(yàn)條件.

核酸檢測(cè)方法在病毒檢測(cè)中耗時(shí)比較長(zhǎng)，是該方法的一大弊端.例如：Shigemoto等[14]用多重?zé)晒釸T-PCR方法檢測(cè)諾如病毒，實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)長(zhǎng)6 h；劉樂庭等[15]采用基于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)，能準(zhǔn)確檢出H7亞型禽流感病毒，但通常需要4～6 h；在HIV病毒的血液篩查中應(yīng)用最廣泛的定量核酸檢測(cè)方法是反轉(zhuǎn)錄 PCR法，利用雅培和羅氏等制造商提供的自動(dòng)血漿處理器和檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)過程均需要6～8 h[16].相比較，Duan等[7]用納米酶試紙條的方法檢測(cè)埃博拉病毒，30 min內(nèi)就能得到精確的檢測(cè)結(jié)果，消耗時(shí)長(zhǎng)的優(yōu)劣非常明顯.

這些因素都導(dǎo)致核酸檢測(cè)方法不能完全滿足病毒快速篩查和實(shí)時(shí)檢測(cè)的需求.

3 納米酶的發(fā)展

酶是生物有機(jī)體內(nèi)具有特定催化功能的蛋白質(zhì)、核酸或蛋白-核酸復(fù)合體.天然酶催化效率相當(dāng)高，并且具有底物專一性，但是天然酶穩(wěn)定性差，容易失活，并且價(jià)格昂貴、不易獲得.用化學(xué)方法合成既具有酶活性，又成本低廉、便于大量獲得，還能在非生理?xiàng)l件下應(yīng)用的人工模擬酶，一直是科學(xué)家努力的方向.

閻錫蘊(yùn)院士課題組2007年首次研究發(fā)現(xiàn)無機(jī)納米材料本身具有類似天然酶的催化活性[17-18],打破Fe3O4納米材料被認(rèn)為是惰性無機(jī)物的傳統(tǒng)觀念，并建立過氧化物納米酶動(dòng)力學(xué)及催化活性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[19],開啟了新一代人工模擬酶發(fā)展和應(yīng)用的新篇章.

納米酶是本身具有酶活性的納米材料，它完全不同于過去將天然酶或者催化配基固定在納米材料上從而發(fā)揮催化作用的物質(zhì)[17].自2007年被首次發(fā)現(xiàn)后，已有上百種納米酶被發(fā)現(xiàn)，模擬催化活性有過氧化物酶家族的過氧化物酶[20-21]、谷胱甘肽過氧化物酶[22]、鹵素過氧化物酶[23]等，氧化酶家族的葡萄糖氧化酶[24]、亞硫酸氧化酶[25]等，以及過氧化氫酶[26]和超氧化物歧化酶[27]等.目前，全世界已經(jīng)有超過200個(gè)研究團(tuán)隊(duì)從事納米酶研究，尤其在過去5年里有超過1 100份關(guān)于納米酶的研究報(bào)告發(fā)表[28].

3.1 納米酶的優(yōu)勢(shì)

納米酶相較于天然酶和其他人工模擬酶，具有獨(dú)特的性能和優(yōu)勢(shì).第一，納米酶可以大規(guī)模生產(chǎn)，價(jià)格相對(duì)低廉.由于天然酶在體內(nèi)的含量很低，比較難以大量獲得，人工合成酶的過程復(fù)雜，成本較高，而無機(jī)納米酶物質(zhì)相比就很容易生產(chǎn)，且成本低、效率高.第二，納米酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性.Gao等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)300 nm粒徑的Fe3O4磁納米顆粒在pH為1～12、溫度為25～60 ℃、H2O2濃度為0.001～2.260 mol/L的范圍，均具有酶活性.而天然酶的成分大多是蛋白質(zhì)，遇到熱、酸、堿等非生理?xiàng)l件，很容易變性失活.第三，納米酶很容易循環(huán)再利用.納米酶在催化過程中沒有物質(zhì)損失，可重復(fù)利用，并且回收相對(duì)便利，例如磁性納米材料通過外加磁場(chǎng)即可回收.第四，納米酶雙功能甚至多功能的理化特征，是天然酶或者其他人工模擬酶不可比擬的.首先，納米顆粒由于受到量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等作用，往往具有電學(xué)、磁性、光學(xué)等獨(dú)特性質(zhì)，例如碳納米點(diǎn)不僅具有催化活性，還可產(chǎn)生熒光[29];其次，納米酶能夠隨著環(huán)境變化改變活性或者酶的類型，比如在酸性環(huán)境下(pH=3.6) Fe3O4納米酶表現(xiàn)出過氧化物酶的活性，而在中性或者堿性條件下表現(xiàn)出過氧化氫酶的活性[18];并且由于納米材料比表面積大，表面電荷豐富，往往表面相原子配位不足，納米材料表面形態(tài)復(fù)雜，可以實(shí)現(xiàn)異原子摻雜或者引入配體，實(shí)現(xiàn)多功能一體化.

鑒于納米酶所具有的穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉和酶活性可調(diào)節(jié)等特性，將納米酶方法應(yīng)用到病毒檢測(cè)中不僅符合當(dāng)前發(fā)展實(shí)時(shí)快速檢測(cè)技術(shù)的趨勢(shì)，而且具有特殊的優(yōu)勢(shì).第一，利用納米酶的多功能理化特征，將磁納米材料的催化性能、磁性與顯色效應(yīng)結(jié)合，使催化、分離與顯色指示同步實(shí)現(xiàn)，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間；第二，納米酶在病毒檢測(cè)中通過顯色反應(yīng)，使檢測(cè)信號(hào)擴(kuò)大，不僅快速高效，靈敏度也顯著提高；第三，金屬納米材料在催化反應(yīng)過程中磁性不會(huì)發(fā)生改變，通過外加磁場(chǎng)能對(duì)納米酶進(jìn)行有效分離和回收，可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用.

3.2 納米酶的催化機(jī)制

納米酶受量子尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)、表面修飾等因素影響，催化活性主要取決于納米材料表面的電子轉(zhuǎn)移狀況，通過調(diào)節(jié)納米材料的大小、形狀、結(jié)構(gòu)、表面取代基等，改變納米酶的催化活性.許多納米酶具有相同的催化活性，但是催化機(jī)制并不相同.下面以幾種主要的納米酶為例，簡(jiǎn)要闡述其催化活性和催化機(jī)制.

3.2.1 基于金屬的納米酶

基于金屬的納米酶通常由過渡金屬氧化物、金屬鹵代物、金屬硫化物或者貴金屬等納米材料構(gòu)成，納米酶和催化底物之間往往伴隨著電子轉(zhuǎn)移，在金屬化合物中化合價(jià)發(fā)生變化，而在貴金屬納米材料中不發(fā)生化合價(jià)的變化，但是貴金屬表面大量電子聚集，產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)在氧化還原反應(yīng)過程中起到重要作用.

Gao等[18]研究表明，F(xiàn)e3O4納米酶的催化活性主要受酶表面Fe2+/Fe3+間轉(zhuǎn)換影響，在H2O2存在時(shí)，能催化底物TMB或OPD或DAB發(fā)生顏色反應(yīng).Chen等[30]通過研究氧化還原電位發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+/Fe3+的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位低于TMB，說明Fe2+/Fe3+不能直接將電子從TMB傳遞到H2O2.利用電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)的方法，檢測(cè)到在Fe3O4納米酶存在的反應(yīng)體系中有羥基自由基(·OH)存在.Fe3O4納米酶的催化機(jī)制符合兵乓機(jī)制[18],即Fe3O4納米酶首先催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，之后Fe3O4納米酶與羥基自由基(·OH)復(fù)合物氧化氫供體底物(如TMB、OPD、DAB)顯色.

Shionoiri等[31]在用諾如病毒的替代模型——貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV) 研究碘化亞銅納米顆粒(copper iodide nanoparticles，CuI NPs) 的抗病毒特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)溶液中的Cu+通過類芬頓反應(yīng)(Fenton-like reactions)產(chǎn)生了活性氧，正是超氧負(fù)離子(O2·-)或羥基自由基(·OH)這樣的活性氧，導(dǎo)致病毒衣殼蛋白被氧化降解和破壞.

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他們的研究還發(fā)現(xiàn)，CuI納米顆粒大量的表面積(100～400 nm；平均直徑160 nm)促進(jìn)了亞銅離子的有效釋放.這表明，納米材料由于表面與界面效應(yīng)，使物質(zhì)的性質(zhì)、性能發(fā)生了一些質(zhì)變.

貴金屬例如Au、Pt納米酶在催化反應(yīng)中不發(fā)生價(jià)態(tài)變化，貴金屬納米顆粒表面富集高密度自由電子，極容易產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，例如氧分子在貴金屬納米材料表面活化裂解，形成單線態(tài)氧，使其具有過氧化物酶活性[32].金納米顆粒表面因?yàn)榫奂舜罅孔杂呻娮?，被光激發(fā)后，電子振蕩到遠(yuǎn)離原子核的一側(cè)，而原子核在另一側(cè)帶正電荷，從而產(chǎn)生偶極等離子體[8].光敏分子作為輔助因子，能夠可逆地調(diào)節(jié)金納米顆粒的催化活性[33].

3.2.2 基于碳的納米酶

碳基納米材料由于具有豐富的比表面積、較好的吸附能力和電子傳遞性，作為納米酶也越來越多地被應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)、疾病監(jiān)控、治療等多方面.

研究發(fā)現(xiàn)，富勒烯能夠清除超氧負(fù)離子(O2·-)自由基，具有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[34].碳納米點(diǎn)、氧化石墨烯、碳納米管等碳基納米材料在雙氧水的存在下，表現(xiàn)出過氧化物酶活性[35].2011年，單壁納米管(single-walled carbon nanotubes, SWCNTs)的過氧化物酶活性被發(fā)現(xiàn)[36],在雙氧水的存在下，能夠催化底物TMB發(fā)生顯色反應(yīng).與辣根過氧化物酶相似，SWCNTs的催化活性依賴底物濃度，底物顏色表現(xiàn)出對(duì)反應(yīng)時(shí)間的依賴性.

3.2.3 基于金屬- 碳雜交體的納米酶

碳納米材料能夠有效分散和穩(wěn)定納米顆粒和小分子，能顯著提高模擬酶的活性.Fan等[38]研究發(fā)現(xiàn)合成的Fe3O4與多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)復(fù)合物，過氧化物酶活性高于單獨(dú) Fe3O4納米酶，這是因?yàn)镸WCNTs的作用使Fe3O4納米顆粒穩(wěn)定、不易聚集并且均勻分布，大大提高了其過氧化物酶活性；同時(shí)金屬納米材料所具有的磁性沒有改變，能夠通過外加磁場(chǎng)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行有效分離和回收，經(jīng)過5次回收后仍然具有過氧化物酶活性[39].Wang等[40]研究表明，碳納米管具有導(dǎo)電率高、表面積大、機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)惰性強(qiáng)等特性，結(jié)合像Fe3O4納米顆粒這樣導(dǎo)電性差的物質(zhì)，能夠顯著改善納米酶活性.Xue等[41]研究血紅素與石墨烯的復(fù)合物，二者通過π-π鍵堆疊相互作用而結(jié)合，由于石墨烯的支撐作用，使血紅素保持了天然酶中單分子狀態(tài)的催化活性，具有非常高的催化能力和底物結(jié)合能力；同時(shí)，石墨烯載體還可以阻斷卟啉分子的一側(cè)，阻止過氧化氫從兩側(cè)進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致血紅蛋白因?yàn)楸谎趸档痛呋钚?

對(duì)納米酶催化機(jī)制的了解，不僅可以促進(jìn)構(gòu)建更多催化活性高、靶向特異性強(qiáng)的納米酶，同時(shí)也必將有助于啟發(fā)納米酶在實(shí)際應(yīng)用方面的設(shè)計(jì).

4 納米酶在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

由于納米酶具有較高的穩(wěn)定性、低廉的價(jià)格和可調(diào)節(jié)的生物酶活性，越來越顯示出廣闊的應(yīng)用前景，應(yīng)用在體外檢測(cè)方面也顯示出強(qiáng)大的適用性和較強(qiáng)的靈敏度.

4.1 基于納米酶的免疫試紙條法

閻錫蘊(yùn)課題組繼首次發(fā)現(xiàn)納米酶之后，充分利用納米酶的多功能理化特征，將磁納米材料的催化活性、磁性與顯色效應(yīng)相結(jié)合，2015年成功研制用于埃博拉病毒(EBoV)快速檢測(cè)的“納米酶試紙條”[7].該技術(shù)將傳統(tǒng)試紙條中的膠體金替換為磁納米酶，利用納米酶的磁性特征對(duì)樣品進(jìn)行分離和富集，同時(shí)利用納米酶的催化特性使底物顯色，測(cè)試靈敏度比常規(guī)試紙條法高100倍.納米酶試紙條的設(shè)計(jì)方案如圖1所示，圖1(a)為標(biāo)準(zhǔn)膠體金試紙條法；圖1(b)用磁性納米材料(magnetic nanoparticles，MNPs)代替膠體金作為探針，磁性納米材料探針本身具有酶活性，能夠催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，增強(qiáng)信號(hào)作用，使結(jié)果肉眼可見.

圖1 納米酶試紙條設(shè)計(jì)方案[7]Fig.1 Nanozyme-strip design[7]

這項(xiàng)新技術(shù)不僅為埃博拉等病毒的快速檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便手段，還可以通過切換探針上的抗體種類，應(yīng)用于新布尼亞、流感等其他病毒的檢測(cè)，隨著科研人員的廣泛研究，納米酶在病毒檢測(cè)應(yīng)用上發(fā)揮了越來越重要的作用.

劉鍵等[3]建立的免疫磁珠酶催化技術(shù)，用于H7N9流感病毒高靈敏檢測(cè)，靈敏度比膠體金法可提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí).該方法利用磁納米顆粒具有過氧化物酶活性的特征，將H7N9鼠單克隆抗體M-H7N9與磁珠納米顆粒孵育交聯(lián)，做成免疫磁納米抗體探針.用硝酸纖維素膜制作免疫磁納米酶催化試紙條，檢測(cè)線(T線)噴涂H7N9兔多克隆抗體R-H7N9，對(duì)照線(C線)噴涂羊抗鼠抗體.混合免疫磁納米抗體探針與待測(cè)溶液，插入免疫磁珠酶催化試紙條.

高敏感免疫磁珠酶催化試紙條檢測(cè)技術(shù)如圖2所示，當(dāng)免疫抗體探針與樣品中的H7N9病原體結(jié)合后，層析至試紙條的檢測(cè)線(T線)與對(duì)照線(C線)時(shí)，就會(huì)被T線噴涂的抗體捕獲、與C線處的羊抗鼠抗體結(jié)合，在2條線處形成磁珠納米顆粒的聚集，這時(shí)加入過氧化物酶的底物如DAB，在過氧化氫存在下，磁性納米顆粒的酶催化DAB發(fā)生顯色反應(yīng)，生成的大量棕褐色沉淀將檢測(cè)信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)H7N9的快速高敏感檢測(cè).

圖2 高敏感免疫磁珠酶催化試紙條檢測(cè)技術(shù)[3]Fig.2 High sensitive strip of immune-magnetic beads[3]

4.2 基于納米酶的比色免疫測(cè)定法

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是副黏病毒屬的單鏈RNA病毒[42],能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病，RSV還能誘發(fā)其他疾病，雖然致死率不高，但是會(huì)造成全球范圍的健康問題，由于目前缺乏安全有效的疫苗，發(fā)展高靈敏度的病毒檢測(cè)方法，進(jìn)行早期診斷和治理尤為重要.

Zhan等[43]創(chuàng)建了基于汞離子- 金納米顆粒- 氧化石墨烯雜交體的比色免疫方法，檢測(cè)呼吸道合胞病毒.該方法用雜交體與病毒抗體連接，通過抗原抗體結(jié)合并在過氧化氫存在下與過氧化物酶底物TMB反應(yīng)并顯色，病毒檢出限(limit of detection, LOD)達(dá)到0.04 pg/mL，比商業(yè)化的酶聯(lián)免疫測(cè)試盒(LOD：4 pg/mL)靈敏度高100倍.

該方法應(yīng)用了納米材料的過氧化物酶活性，同時(shí)采用金納米顆粒(AuNPs)與氧化石墨烯(graphene oxide, GO)雜合，如圖3所示，使金納米顆粒附著在氧化石墨烯片層表面，達(dá)到較高的分散度，受這種協(xié)同作用機(jī)制的影響，相對(duì)于單獨(dú)存在的金納米顆?；蜓趸?，雜交體表現(xiàn)出顯著提高的過氧化物酶活性.在H2O2存在下，能夠使TMB氧化產(chǎn)生顏色反應(yīng).

圖3 基于Hg2+-AuNPs-GO雜交體用于RSV檢測(cè)的比色免疫測(cè)定法示意圖[43]Fig.3 Schematic representation of the Hg 2+-AuNPs-GO hybrids for colorimetric immunoassay of RSV[43]

然而，納米酶會(huì)因?yàn)楸砻婕虞d血清蛋白或DNA而降低酶活性[44-45],納米酶的作用機(jī)制表明，酶底物結(jié)合位點(diǎn)在納米材料表面，而納米酶如果與其他生物分子相連接，生物分子會(huì)占據(jù)酶表面積，阻礙底物結(jié)合，甚至?xí)鹈妇奂?，從而降低酶活?研究表明，金納米顆粒表面沉積大量的金屬原子或者金屬離子能夠增強(qiáng)金納米的酶活性[46-47],Ag+、Li+、Pb2+、Hg2+、Al3+、Pt4+等離子都表現(xiàn)出增強(qiáng)酶活性的能力，尤其是Hg2+-Au的金屬親和性，Hg2+使金納米顆粒表面聚集大量的汞原子，比其他金屬離子更能提高酶活性.金納米顆粒- 氧化石墨烯因?yàn)榻Y(jié)合了病毒抗體使酶活性喪失，但是Hg2+的摻雜能夠恢復(fù)其過氧化物酶活性.

該方法的設(shè)計(jì)思路充分考慮了納米酶的特點(diǎn)和催化機(jī)制，用納米酶代替容易失活的天然酶，同時(shí)根據(jù)納米酶特點(diǎn)使催化與顯色反應(yīng)一體化，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了靈敏度.

4.3 基于納米酶的熒光測(cè)定法

HIV病毒是導(dǎo)致人類獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的致病菌，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，其基因組是2條相同的RNA.目前HIV病毒檢測(cè)多采用血清病毒抗體的檢測(cè)方法，但是人體感染HIV病毒后短則幾周、長(zhǎng)到幾個(gè)月體內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生抗體，所以不利于早期診斷.而人體感染HIV后宿主細(xì)胞能迅速產(chǎn)生HIV DNA，針對(duì)HIV DNA的檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)快速、早期診斷[48].

Lin等[49]設(shè)計(jì)的基于納米酶“三明治”復(fù)合物熒光檢測(cè)方法，用結(jié)合納米酶和安培紅(amplex red, AR)的HIV病毒互補(bǔ)DNA片段檢測(cè)病毒DNA，將病毒HIV互補(bǔ)DNA裂解為2段，其中一段CHIV1與PtAu合金納米顆粒相連，形成寡聚核酸鏈修飾的合金納米顆粒CHIV1-PtAuNPs,另一段CHIV2與磁性納米顆粒MNPs相連接.

與HIV DNA混合共育后形成“三明治”復(fù)合物CHIV1-PtAuNPs/DNA/CHIV2-MNPs,磁性納米顆粒MNPs與靶標(biāo)DNA結(jié)合后，能通過外加磁場(chǎng)定向分離，經(jīng)過吸附、清洗和解吸，將靶標(biāo)物質(zhì)與其他樣品殘余分離，從而得到高濃度和高純度的靶標(biāo)結(jié)合分子；雙金屬納米顆粒PtAuNPs具有過氧化物酶活性，與靶標(biāo)DNA結(jié)合后，經(jīng)過外加磁場(chǎng)分離，不會(huì)被去除，在過氧化氫H2O2存在下能催化氧化非熒光底物安培紅AP成為熒光性很強(qiáng)的試鹵靈(resorufin)，好似打開熒光開關(guān)，被熒光儀記錄，LOD達(dá)到5×10-12mol/L.非靶標(biāo)DNA因?yàn)椴荒芘cPtAuNPs和MNPs結(jié)合形成“三明治”復(fù)合物，通過外加磁場(chǎng)分離作用能把DNA和PtAuNPs去除，溶液加入安培紅AP不能產(chǎn)生熒光.

該方法利用了雙金屬納米酶的過氧化物酶活性，在過氧化氫存在下能把無熒光性的底物氧化成為具有強(qiáng)熒光性的物質(zhì)，同時(shí)利用納米酶的磁性分離去除未結(jié)合的DNA，創(chuàng)建了無酶、無熒光標(biāo)記的熒光檢測(cè)方法，簡(jiǎn)化檢測(cè)過程，增加特異性，提高檢測(cè)靈敏度.

4.4 基于納米酶的酶聯(lián)免疫吸附法

麻疹病毒(measles virus, MV)屬副黏病毒[50],是麻疹的病原體，在兒童當(dāng)中是一種常見的急性傳染病.麻疹傳染性極強(qiáng)，任何沒患過麻疹又沒接種過麻疹疫苗的人接觸后幾乎全部發(fā)病，病癥以皮丘疹、發(fā)熱及呼吸道癥狀為特征.

Long等[51]在麻疹病毒檢測(cè)中，采用具有過氧化物酶活性的“金核鉑殼”納米棒(Au@Pt NRs)與抗原結(jié)合，建立基于納米酶的酶聯(lián)免疫吸附法，麻疹病毒的檢出限為10 ng/mL，是商品化酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢出限的1 000倍.該方法利用鉑的優(yōu)秀催化作用，同時(shí)為避免鉑容易產(chǎn)生的聚集而影響酶活力，使鉑附著在金納米棒的表面，增加鉑的分散度，增強(qiáng)酶活力.

圖4 “金核鉑殼”納米棒與麻疹抗原偶聯(lián)物的ELISA系統(tǒng)免疫分析過程示意圖[51]Fig.4 Illustrated process of the immunoassay of Au@Pt NR-antigen conjugates based ELISA system[51]

如圖4所示，在該方法中，納米酶抗原復(fù)合物探針是由“金核鉑殼”納米棒(Au@Pt NRs)與麻疹抗原結(jié)合形成，96孔板預(yù)先由鼠抗人抗體IgM包被，麻疹抗體IgM通過孵育與固相結(jié)合，經(jīng)過洗脫，非特異性交聯(lián)的部分被洗脫掉.納米酶抗原復(fù)合物探針加入后，探針中的抗原被麻疹抗體捕獲，探針被吸附到固相載體.洗脫掉未結(jié)合成分后，加入過氧化物酶底物TMB和過氧化氫，在納米酶作用下發(fā)生顯色反應(yīng)，從而使靈敏度提高3個(gè)數(shù)量級(jí).

4.5 基于納米酶的適配體探針顯色法

人諾如病毒(human Norovirus，NoV)是杯狀病毒科中諾如病毒屬的一種病毒，能在全球范圍內(nèi)引起急性腸胃炎的食源性病原體，食品基質(zhì)的復(fù)雜性很大程度上影響了病毒檢測(cè)的效果.當(dāng)前，諾如病毒定量檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是基于基因擴(kuò)增技術(shù)的方法，例如逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)等，雖然也有一些其他方法被報(bào)道，但是當(dāng)前檢測(cè)敏感性最強(qiáng)的是一種以適配體探針結(jié)合諾如病毒的電化學(xué)傳感器方法[52],檢測(cè)鼠諾如病毒(murine Norovirus, MNV)的檢出限LOD達(dá)到6 000 MNV/mL，這個(gè)值仍然遠(yuǎn),遠(yuǎn)達(dá)不到病毒感染劑量中值(50% infective dose, ID50)的最低限度.

在實(shí)驗(yàn)中，由于MNV是一種易于培養(yǎng)的傳染性人諾如病毒的替代物，Weerathunge等[53]通過MNV模型，建立起適配體AG3與金納米酶相結(jié)合的適配體探針顯色法，病毒檢出限LOD達(dá)到30 viruses/mL，是目前為止檢出限的最低值，而且檢測(cè)時(shí)間只要10 min.

Weerathunge等建立的適配傳體探針顯色法，是將具有過氧化物酶活性的金納米顆粒(gold nanoparticle, GNP)表面結(jié)合MNV衣殼蛋白特異性適配體AG3，適配體AG3的結(jié)合使金納米酶失去酶活性，金納米顆粒被鈍化.將這種被鈍化的GNP-AG3偶聯(lián)物作為探針，檢測(cè)待測(cè)液中的MNV，一旦有病毒，適配體AG3就會(huì)與病毒衣殼蛋白特異性結(jié)合并改變AG3的構(gòu)象，適配體AG3構(gòu)象改變后即從金納米顆粒表面解離下來，從而恢復(fù)了金納米顆粒的過氧化物酶活性，在H2O2存在下使TMB溶液顯藍(lán)色.對(duì)于其他病毒或者蛋白質(zhì)，適配體AG3不會(huì)與之結(jié)合，納米酶就無法恢復(fù)活性，因此不發(fā)生顯色反應(yīng).

該方法利用納米酶過氧化物酶活性及納米酶會(huì)因?yàn)楸砻婕虞d蛋白或核酸而降低酶活性的特征，使用病毒特異性結(jié)合適配體作為酶活性的開關(guān)，結(jié)合使酶活性喪失，解離使酶活性恢復(fù)，同時(shí)利用納米酶的顯色反應(yīng)特征，建立起靈敏度高且快速簡(jiǎn)便的診斷方法.

5 結(jié)論

對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的納米酶催化機(jī)制進(jìn)行了梳理和歸納，綜述了近年來基于納米酶在病毒檢測(cè)方面的新技術(shù)、新方法.隨著納米酶、材料科學(xué)、分析技術(shù)等領(lǐng)域新研究新成果的不斷涌現(xiàn)，極大地促進(jìn)了實(shí)時(shí)快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)范圍不斷擴(kuò)大，不僅精準(zhǔn)度高、可靠性強(qiáng)，而且快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效，非專業(yè)人員也便于操作.納米酶有望替代天然酶，不僅在病毒檢測(cè)領(lǐng)域，而且在其他生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護(hù)、疾病治療等各領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用.

納米酶的研究同時(shí)也面臨許多挑戰(zhàn)，在病毒檢測(cè)領(lǐng)域，需要重點(diǎn)關(guān)注以下幾個(gè)問題：

1) 納米酶具有天然酶所不具備的可調(diào)節(jié)性和可設(shè)計(jì)性，納米酶的形貌、尺度、表面修飾狀況、組成成分的比例、反應(yīng)體系微環(huán)境等，都能夠影響酶的活性甚至改變酶的屬性，因此設(shè)計(jì)基于納米酶的檢測(cè)方法時(shí)，要充分考慮這些因素，反復(fù)摸索適合的條件，才能構(gòu)建更加高效的實(shí)驗(yàn)方法.

2) 納米酶缺乏特異性[54],表面修飾雖然能夠提高特異性，但是會(huì)影響酶活力，如何設(shè)計(jì)巧妙的級(jí)聯(lián)作用，利用好特異性與表面修飾的關(guān)系，需要扎實(shí)的生物學(xué)理論基礎(chǔ)和不斷創(chuàng)新思維的結(jié)合.

3) 納米酶具有可塑性和多功能性，因此需要繼續(xù)深入研究納米酶的催化機(jī)理，通過對(duì)比天然酶的活性及作用機(jī)制，設(shè)計(jì)合適的納米酶以適應(yīng)多領(lǐng)域的應(yīng)用需求.

4) 納米材料易于聚集，具有不穩(wěn)定性，這也是納米酶在應(yīng)用方面的一個(gè)挑戰(zhàn)，在應(yīng)用中往往需要設(shè)計(jì)納米酶與化學(xué)惰性強(qiáng)、表面積大的物質(zhì)形成復(fù)合物，使納米顆粒不易聚集，充分發(fā)揮酶的作用，這些都是需要考慮的方面.

致謝感謝中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所段德民研究員對(duì)本文給予的建議和指導(dǎo).