張 琦，史文倩，段步婷，崔小珍，郭露露，張 昱，鄭明學(xué)，白 瑞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

雞球蟲病是由9 種艾美耳球蟲引起，侵入雞腸上皮細(xì)胞引發(fā)的一種寄生性原蟲病[1]。全世界每年因雞球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[2]。其臨床癥狀主要為血痢，腸道受損[3]。9 種雞球蟲中，以柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）的危害最大，主要侵害盲腸[4]。目前，大多研究者進(jìn)行柔嫩艾美耳球蟲體外研究時(shí)，主要用原代雞腎細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞作為細(xì)胞模型，而柔嫩艾美耳球蟲真正的宿主細(xì)胞是盲腸上皮細(xì)胞[5]。因此，為了進(jìn)一步研究柔嫩艾美耳球蟲入侵和損傷機(jī)制，進(jìn)一步研制阻斷柔嫩艾美耳球蟲入侵和損傷宿主細(xì)胞的藥物，需要建立一個(gè)雞胚盲腸上皮細(xì)胞（Chick embryo cecal epithelial cells，CECECs）的體外培養(yǎng)模型。

胰島素是由胰島B 細(xì)胞受到內(nèi)源性或外源性物質(zhì)（葡萄糖、核糖、胰高血糖素等）的調(diào)節(jié)，經(jīng)過胞吐方式分泌的一種蛋白質(zhì)類激素[6]。它的作用主要有增強(qiáng)合成代謝及生長(zhǎng)發(fā)育、維持糖代謝穩(wěn)態(tài)與能量平衡[7]。胰島素是一種在一定濃度內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵性生長(zhǎng)因子，能夠調(diào)節(jié)糖類、蛋白質(zhì)的分解利用[8]，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化[9]，是一些細(xì)胞合成培養(yǎng)基中必不可少的成分。目前，確認(rèn)的胰島素生物效應(yīng)是通過調(diào)控活化細(xì)胞中的蛋白激酶、磷酸酶等級(jí)聯(lián)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能[10]。胰島素發(fā)揮生物效應(yīng)的主要信號(hào)通路有2 條，一是Ras 途徑，二是磷脂酰肌醇3 激酶通路[11]，其作用機(jī)制為：胰島素和細(xì)胞膜上的胰島素受體（IR）結(jié)合進(jìn)而激活酪氨酸激酶的活性，使受體底物（IRS）磷酸化，募集含有SH2 功能域的信號(hào)蛋白，最終發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的作用[12]。

本研究對(duì)體外生長(zhǎng)的CECECs 加入不同濃度的胰島素，觀察該細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，通過比較CECECs克隆形成率、生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)，分析不同濃度胰島素的作用，確定培養(yǎng)基生長(zhǎng)因子的最佳濃度，以便更好地構(gòu)建體外CECECs 生長(zhǎng)模型。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 16 日齡SPF 雞胚，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 DEME/F12 培養(yǎng)基、谷氨酰胺、0.25%胰酶 -EDTA 均購(gòu)自 Gibco公司；角蛋白 18（CK-18）、DAB 顯色劑、表面生長(zhǎng)因子（EGF）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自Sigma 公司；胰島素、氫化可的松、青鏈霉素混合液、嗜熱菌蛋白酶均購(gòu)自Biolegend公司；纖連蛋白、肝素鈉、MTT 試劑盒、PBS、0.4%臺(tái)盼藍(lán)、丙氨酸鈉均購(gòu)自Solarbio 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；山羊血清、羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞胚盲腸上皮細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 取16 日齡的SPF 雞胚，在無菌條件下分離盲腸，去除腸系膜及周圍結(jié)締組織，用含雙抗PBS 緩沖液漂洗5 次，每次3 min。剪成約1 mm3組織塊，置于50 μg/mL 的嗜熱菌蛋白消化酶中，并將其置于振蕩培養(yǎng)箱（37 ℃，80 r/min）中恒溫振蕩消化2 h。待消化完成后，置于低溫離心機(jī)中1 000 r/min 離心5 min。棄去上清，將沉淀在含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸，輕輕吹打混勻，然后將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，41 ℃，8%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70 min，貼壁差便于去除成纖維細(xì)胞。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心5 min，沉淀在含2.5%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸，并計(jì)數(shù)，按20 萬/孔的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于41 ℃，8%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液一次[13]，倒置熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察拍照。

1.2.2 胰島素對(duì)雞胚盲腸上皮細(xì)胞克隆形成率的測(cè)定 將長(zhǎng)勢(shì)較好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞先用0.25%的胰蛋白酶-EDTA 消化，然后將細(xì)胞懸液接種于2.5%的胎牛血清培養(yǎng)基中。設(shè)置每組胰島素的質(zhì)量濃度分別為 5、10、15、20 μg/mL，并設(shè)置對(duì)照組胰島素質(zhì)量濃度為0 μg/mL，每一個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)孔。各組以50、100、200 個(gè)細(xì)胞的梯度倍數(shù)稀釋懸浮液分別接種于10 mL 培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞分布均勻，置于 CO2培養(yǎng)箱（41 ℃，8%CO2）中培養(yǎng)14 d。每天觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)觀察到有明顯的細(xì)胞克隆現(xiàn)象時(shí)，停止對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)，將上清液吸棄至廢液缸，再用PBS 沖洗貼壁細(xì)胞2 次，用4%的甲醛固定15 min，棄去固定液，然后用姬薩姆染色液染色20 min，流動(dòng)水沖洗掉染色液，自然風(fēng)干。倒置培養(yǎng)皿并在培養(yǎng)皿上加一張透明的網(wǎng)格紙，在顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)大于10 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，最后計(jì)算克隆形成率。

1.2.3 雞胚盲腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（率）的測(cè)定分別將不同濃度胰島素配制雞胚盲腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，用96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，連續(xù)8 d 用MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力，取3 組平行數(shù)據(jù)，用酶標(biāo)儀于490 nm 處測(cè)定吸光度值，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制各組盲腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 上皮細(xì)胞角蛋白18（CK-18）鑒定 將原代的雞胚盲腸上皮細(xì)胞懸液接種于鋪有細(xì)胞爬片的6 孔板中，41 ℃，8%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁率為80%時(shí)，用PBS 緩沖液沖洗已爬片的細(xì)胞3 次。用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌3 次；室溫滴加山羊血清處理20 min；加入CK-18 一抗，37 ℃孵育2 h，PBS 洗滌3 次；然后加入羊抗鼠二抗，避光37 ℃孵育 1 h，PBS 洗滌 3 次；DAB 顯色，PBS 洗滌3 次。蘇木精復(fù)染，封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics v25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素ANOVA 方差分析，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚盲腸上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

在CECECs 培養(yǎng)基中加入不同濃度的胰島素，培養(yǎng)72 h 后在倒置顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞。培養(yǎng)基中不添加胰島素時(shí)，視野下細(xì)胞數(shù)較少且呈圓形，細(xì)胞散在分布（圖1-A）。添加5 μg/mL 的胰島素時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多，聚集生長(zhǎng)呈島嶼狀分布，少數(shù)細(xì)胞呈散在分布（圖1-B）。添加10 μg/mL 的胰島素時(shí)，細(xì)胞數(shù)量顯著增多，密度增加，細(xì)胞之間緊密連接，均勻分布（圖1-C）。添加15 μg/mL 的胰島素時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少，聚集成島嶼狀的細(xì)胞減少，呈散在分布，細(xì)胞呈圓形或橢圓形（圖1-D）。添加20 μg/mL的胰島素時(shí)，細(xì)胞數(shù)量顯著增多，多數(shù)呈聚集分布，少數(shù)散在分布（圖1-E）。培養(yǎng)7 d，CECECs 呈典型的鵝卵石樣（圖1-F）。

2.2 胰島素對(duì)CECECs 克隆形成率的測(cè)定結(jié)果

由圖2 可知，與不添加胰島素組（CK）相比，5 μg/mL 的胰島素對(duì)雞胚盲腸上皮細(xì)胞克隆形成有明顯促進(jìn)作用。胰島素在10 μg/mL 時(shí)，盲腸上皮細(xì)胞克隆形成效果最顯著，細(xì)胞增長(zhǎng)形成率明顯增高，差異達(dá)極顯著（P＜0.01）。胰島素在 15 μg/mL 時(shí)，盲腸上皮細(xì)胞克隆形成率略有增高，但與10 μg/mL組的細(xì)胞克隆形成率間差異不顯著（P＞0.05）。胰島素在20 μg/mL 時(shí)，盲腸上皮細(xì)胞克隆增長(zhǎng)率依然略有增高，但與15 μg/mL 組間差異不顯著（P＞0.05）。因此，10 μg/mL 是促進(jìn)細(xì)胞克隆形成的最佳質(zhì)量濃度。

2.3 雞胚盲腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果

從圖3 可以看出，體外培養(yǎng)的雞胚盲腸上皮細(xì)胞，各組細(xì)胞1～2 d 生長(zhǎng)緩慢，第3 天開始進(jìn)入倍增生長(zhǎng)期，添加胰島素 10、15、20 μg/mL 組生長(zhǎng)至第5 天達(dá)到細(xì)胞平臺(tái)期，之后生長(zhǎng)較為緩慢，且組間差異不顯著（P＞0.05）。但與不添加胰島素組（CK）、5 μg/mL 胰島素組間差異達(dá)極顯著 （P＜0.01），細(xì)胞生長(zhǎng)活力旺盛。

2.4 雞胚盲腸上皮細(xì)胞CK-18 免疫細(xì)胞染色結(jié)果

采用免疫細(xì)胞染色法鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞中CK-18 的表達(dá)，結(jié)果顯示（圖4），細(xì)胞呈上皮細(xì)胞特有的角蛋白陽性。說明本試驗(yàn)分離得到的細(xì)胞表達(dá)了CK-18，具有上皮細(xì)胞的典型特征，表明生長(zhǎng)克隆的細(xì)胞為CECECs。

3 結(jié)論與討論

胰島素是一種具有同化作用的生長(zhǎng)因子，是細(xì)胞分裂和代謝的重要調(diào)節(jié)因子。胰島素能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以及葡萄糖的氧化分解，釋放能量供機(jī)體利用，從而刺激細(xì)胞的增殖分化[15]。胰島素對(duì)DNA、RNA、ATP 的合成有促進(jìn)作用[16]，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。GUNAWARDANA 等[17]研究表明，添加胰島素能夠減少凋亡和促進(jìn)增殖，但同時(shí)存在劑量依存性。謝明權(quán)等[18]研究表明，胰島素具有促進(jìn)原代雞腎細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)球蟲卵囊形成的作用。于宇翔等[19]研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-I）能夠調(diào)節(jié)RNA 和DNA 的合成，促進(jìn)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和分化。在本試驗(yàn)中，在體外培養(yǎng)基中加入了不同濃度的胰島素培養(yǎng)孵育72 h，隨著胰島素濃度的增加，雞胚盲腸上皮細(xì)胞的增殖效應(yīng)和克隆形成率也逐漸增加。當(dāng)胰島素質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)，盲腸上皮細(xì)胞的增殖效應(yīng)最顯著，細(xì)胞克隆形成率最高。與 10 μg/mL 組相比，雖然 15、20 μg/mL 組的細(xì)胞克隆形成率有所增高，但差異不顯著（P＞0.05）。因此在本研究中，10 μg/mL 胰島素是促進(jìn)雞胚盲腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最佳質(zhì)量濃度。這為進(jìn)一步研究雞球蟲對(duì)雞盲腸侵害的機(jī)制有很大幫助。

CK-18 是一種特異性骨架蛋白，存在于上皮細(xì)胞表面[20]，對(duì)于維持上皮組織的完整性及連續(xù)性起著重要作用[21]。研究表明，CK-18 具有高度的保守性和組織分化特性，與上皮細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)[22]。CK-18 作為上皮細(xì)胞表面的特異性蛋白質(zhì)，常被用于檢測(cè)上皮來源的細(xì)胞[23]。尹博文等[24]通過細(xì)胞角蛋白免疫熒光染色鑒定，確定得到了樹鼩小腸上皮細(xì)胞。洪智敏等[25]選用鼠抗雞CK-18 單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為雞胚小腸上皮細(xì)胞。本研究中，利用CK-18 免疫細(xì)胞染色法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞呈陽性，確定為CECECs，且具有上皮細(xì)胞的典型特征。

本研究結(jié)果表明，一定濃度的胰島素可以促進(jìn)雞胚盲腸上皮細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。通過對(duì)該細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL 的胰島素對(duì)雞胚盲腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，并且用免疫細(xì)胞染色法鑒定本試驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)胞為雞胚盲腸上皮細(xì)胞。這為建立一個(gè)完善的體外雞胚盲腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系以及進(jìn)一步研究雞球蟲的損傷機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。