滕曉梅 廖川江 劉暢 徐雨生

摘? ? 要：葡萄葉獼猴桃（獼猴桃科）分布狹窄且現(xiàn)已瀕臨滅絕，本研究完成了對(duì)葡萄葉獼猴桃葉綠體全基因組的排序。結(jié)果顯示，葡萄葉獼猴桃葉綠體全基因組長(zhǎng)度為150 878 bp，其基因組包括130個(gè)基因;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，葡萄葉獼猴桃與水東哥為姊妹類(lèi)群。

關(guān)鍵詞：葡萄葉獼猴桃;瀕危物種;葉綠體全基因組測(cè)序;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

文章編號(hào)：1005-2690（2021）21-0023-03? ? ? ?中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：Q943.2;S663.4? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在植物分子系統(tǒng)學(xué)領(lǐng)域中，葉綠體基因組（Chloroplast DNA，

cpDNA）測(cè)序的方法已成為植物系統(tǒng)發(fā)育研究的最重要方法之一[1]，在物種進(jìn)化及鑒定中具有重要使用價(jià)值。絕大部分葉綠體基因組大小為120～250 kb，呈共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)且由4個(gè)區(qū)域組成：一個(gè)大單拷貝序列區(qū)（Large Single-Copy region，LSC）、一個(gè)小單拷貝序列區(qū)（Small Single-Copy region，SSC）及一對(duì)反向重復(fù)序列區(qū)（Inverted Repeat region，IR）[2]。與核基因組比較，葉綠體基因組序列具有分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且高度保守等優(yōu)點(diǎn)，在胞質(zhì)遺傳、植物系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性等方面發(fā)揮著重要作用[3]。

葡萄葉獼猴桃（Actinidia vitifolia）是獼猴桃科、獼猴桃屬大型落葉藤本，主要分布于中國(guó)四川馬邊、雷波峨邊、峨邊和云南彝良等地，生長(zhǎng)于海拔1 600 m[4]。葡萄葉獼猴桃現(xiàn)已屬瀕危物種，果實(shí)的風(fēng)味甚佳;含有苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等10多種氨基酸以及豐富的礦物質(zhì)（鈣、磷、鐵），對(duì)保持人體健康具有重要的作用;含有較多的果酸，能夠顯著抑制黑色素沉淀及角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)聚力，具有消除或淡化黑斑、改善干性或油性肌膚等功效，被稱(chēng)為“美容圣果”[5-6]。

獼猴桃屬先被分別置于山茶科（Theacea）或五椏果科（Dilleniaceae），Dunn（1911）[7]首次提出，應(yīng)將稱(chēng)獼猴桃屬（Actinidia Lindl）、水東哥屬（Saurauia Willd）、藤山柳屬（Clematoclethra Maxim）分別從五椏果科或山茶科分出放在一起的設(shè)想。Gilg（1925）[8]建立了包括這3個(gè)近緣屬的獼猴桃科。本研究對(duì)葡萄葉獼猴桃葉綠體全基因組進(jìn)行排序，挑選獲得獼猴桃屬19種、水東哥屬1種，同時(shí)挑選剛毛藤山柳作為外類(lèi)群建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，為更好地開(kāi)發(fā)利用及保護(hù)葡萄葉獼猴桃提供了參考依據(jù)，同時(shí)為遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

葡萄葉獼猴桃樣本葉采自中國(guó)云南省太平鎮(zhèn)（28°24′40.76″ E，104°7′50.86″ N），其憑證標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館。

1.2? ?儀器與試劑

移液槍?zhuān)?jì)南歐萊博技術(shù)有限公司，型號(hào)為F3系列）;水浴鍋（上海左樂(lè)儀器有限公司），型號(hào)為HH-W420;超微量紫外分光光度計(jì)（Nano Drop 2000）（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司），型號(hào)為Anodrop one-c;高通量組織研磨儀（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司），型號(hào)為Daxluot-24;冰箱（濟(jì)南童鑫生物科技有限公司），型號(hào)為BDF-25H110;干燥器，型號(hào)為2892;2×CTAB緩沖液（上海尚寶生物科技有限公司），型號(hào)為R21954-500;氯仿（分析級(jí)），異戊醇（分析級(jí)）。

1.3? ?試驗(yàn)方法

1.3.1? ?DNA提取

在2 mL離心管（加入一顆鋼珠）中裝入約0.2 g待提材料葉片，將離心管轉(zhuǎn)移至離心管速凍金屬架并放入液氮中速凍2～3 min后，在高通量組織研磨儀中以45 Hz震蕩破碎50 s。分別加入600 μL預(yù)熱的2×CTAB緩沖液（65 ℃的水浴鍋中預(yù)熱），顛倒混勻后，將離心管放入65 ℃的水浴鍋中溫浴30 min。在離心管中加入600 μL的試劑氯仿和異戊醇（體積比為24∶1），顛倒混勻后， 12 000 rpm離心10 min。在通風(fēng)櫥中，將400 μL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL滅菌離心管中后加入冰冷的異丙醇400 μL，作好標(biāo)記，放入-20 ℃冰箱中冰置30 min沉淀DNA。然后，12 000 rpm離心10 min，倒掉上清液。將離心管倒扣在吸水紙上，放置4 h使殘余的異丙醇揮發(fā)后，在離心管中加入200 μL ddH2O，室溫溶解4 h后，隨機(jī)選擇10個(gè)DNA樣品利用Nano Drop 2000檢測(cè)DNA樣品的濃度和純度，將檢測(cè)合格的DNA樣品儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆茫悠稤NA的OD260/OD280值在1.8左右）。

1.3.2? ?測(cè)序

將用硅膠干燥的葉片（合格樣品）送至諾和生物進(jìn)行測(cè)序。采用Illumina測(cè)序方法，該公司會(huì)返回原始數(shù)據(jù)（Raw data）與進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾后的數(shù)據(jù)（二代測(cè)序數(shù)據(jù)，Clean data），其后基于Clean data對(duì)其進(jìn)行葉綠體基因組的組裝。

1.3.3? ?數(shù)據(jù)采集

在iPlant植物智挑選獲得獼猴桃屬19種、水東哥屬1種，再通過(guò)NCBI下載其完整葉綠體基因組序列（FASTA文件），同時(shí)挑選剛毛藤山柳作為外類(lèi)群。

1.3.4? ?葉綠體基因組的組裝和注釋

采用葉綠體基因組組裝軟件（NOVOPlasty v3.1）[9]組裝完整的葉綠體基因組。所得的單個(gè)文件碎片整理程序（contigs）被鑒定并定位到參考基因組中華獼猴桃（Actinidia chinensis）（NC026690）進(jìn)行進(jìn)一步核查。通過(guò)CpGAVAS2[10]和GeSeq[11]對(duì)組裝的葉綠體基因組進(jìn)行注釋。使用生物信息學(xué)軟件（Geneious v.9.0.2）[12]對(duì)起始和終止密碼子進(jìn)行手動(dòng)校正。將正確無(wú)誤的葡萄葉獼猴桃的完整葉綠體基因組序列提交至GenBank（MW420603）。

1.3.5? ?系統(tǒng)發(fā)育分析方法

基于每個(gè)基因組的基因位置獲得基因順序數(shù)據(jù)，利用RAxML8.0構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Maximum Likelihood estimator，ML），計(jì)算支持率時(shí)，將物種數(shù)據(jù)集計(jì)算1 000次重復(fù)[13]。

2? ?試驗(yàn)結(jié)果

2.1? ?葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組特征

葡萄葉獼猴桃葉綠體基因是一個(gè)典型的四方體結(jié)構(gòu)，完整葉綠體基因組長(zhǎng)度為150 878 bp，其中大單拷貝（LSC）區(qū)長(zhǎng)度為82 020 bp，小單拷貝（SSC）區(qū)長(zhǎng)度為17 563 bp，一對(duì)反向重復(fù)區(qū)（IRs）長(zhǎng)度為2 547 bp，總GC含量為38.5%。葡萄葉獼猴桃的葉綠體基因組包括130個(gè)基因，其中包括83個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、8個(gè)核糖體RNA（rRNA）基因和39個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）基因。

2.2? ?系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果

為了確定葡萄葉獼猴桃的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用獼猴桃屬完整葉綠體基因組（19個(gè)序列）、水東哥屬的水東哥（2個(gè)序列）和作為外類(lèi)群的藤山柳屬剛毛藤山柳（1個(gè)序列）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果如圖1，葡萄葉獼猴桃與水東哥為姊妹類(lèi)群。

3? ?討論

葉綠體為光合作用必不可少而存在于所有藻類(lèi)微生物和綠色植物細(xì)胞中，且具有基因組結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定、遺傳物質(zhì)相對(duì)獨(dú)立等較多優(yōu)勢(shì)[14]，因此葉綠體基因組非常適合進(jìn)化學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究。cpDNA在植物總DNA中的含量相當(dāng)豐富，且具有多拷貝、分子量小和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，易于提取和分析。植物葉綠體基因組全序列檢測(cè)結(jié)果可以為其提供廣泛且具體的分子信息，有利于特定基因的分離、鑒定、測(cè)定及構(gòu)建物理圖譜[15-16]。

中國(guó)葡萄葉獼猴桃的分布區(qū)域非常狹窄，該物種已瀕臨滅絕，個(gè)體數(shù)量已不足1 000株。本研究采用Illumina測(cè)序及NOVOPlasty v3.1對(duì)葡萄葉獼猴桃的葉綠體全基因組進(jìn)行測(cè)序，并以發(fā)表的中華獼猴桃序列為參考組裝出葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組。與傳統(tǒng)方法相比，該方法操作較為簡(jiǎn)單，不需要單獨(dú)分離葉綠體和cpDNA，只需提取植物葉片全基因組DNA進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)與參考基因組比較后，將得到的序列結(jié)果與參考基因組Blast對(duì)比，即可輕松找出有效的reads，再用相對(duì)應(yīng)的軟件進(jìn)行組裝，并對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)洞從而獲得完整的全葉綠體基因組。該方法不僅操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低，而且提高了試驗(yàn)的可行性。通過(guò)對(duì)葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序并對(duì)其進(jìn)行特征分析，共注釋得到130個(gè)基因，其中包括83個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、8個(gè)rRNA基因和39個(gè)tRNA基因;蛋白編碼基因?qū)?yīng)的密碼子偏好使用A/T堿基。

試驗(yàn)結(jié)果為后期葡萄葉獼猴桃葉綠體分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了充分的試驗(yàn)資料和參考價(jià)值。對(duì)葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組的研究，有助于更好地研究獼猴桃科的系統(tǒng)發(fā)育和生物地理學(xué)，同時(shí)有助于進(jìn)一步開(kāi)展獼猴桃科植物雜交種質(zhì)鑒定和基于葉綠體DNA數(shù)據(jù)的群體遺傳學(xué)研究。

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