劉 琳，孫曉帥，李 乾，范書(shū)臣，時(shí)鴻迪，馬 鈞，劉丹丹

（1云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明 650091；2西藏大學(xué)理學(xué)院，拉薩 850000；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物所，昆明 650091）

0 引言

蘋(píng)果是薔薇科蘋(píng)果亞科蘋(píng)果屬(Malus)植物，為多年生落葉喬木，是國(guó)內(nèi)主要的落葉果樹(shù)之一，蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收中具有重要地位[1]。國(guó)內(nèi)的主產(chǎn)區(qū)主要分布在四川、河北、河南、遼寧、山東、山西、陜西、甘肅和新疆等地[2]，不同區(qū)域內(nèi)蘋(píng)果的品種和栽培生產(chǎn)方式差異較為明顯，形成了有地域特色的品種優(yōu)勢(shì)，如新疆‘冰糖心富士’、山東‘紅富士’、山西‘秦冠’、河北‘王林’等[3]。中國(guó)具有悠久的蘋(píng)果栽培歷史，是世界上蘋(píng)果種植面積最大、總產(chǎn)量最高的國(guó)家[4]，但良種苗木繁育體系不健全是影響蘋(píng)果產(chǎn)量的重要原因之一[5]。中國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[6]，但自主培育具有地域特色的主栽品種較少，野生和地方特優(yōu)種質(zhì)資源的創(chuàng)新與利用日益突出，因此應(yīng)充分挖掘利用國(guó)內(nèi)資源，擴(kuò)大優(yōu)異基因來(lái)源，為選育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種提供依據(jù)。

國(guó)內(nèi)蘋(píng)果種質(zhì)資源豐富、品種類型多樣，包括大量的野生種、半野生種及栽培品種，在果樹(shù)栽培、生產(chǎn)和育種上具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7-9]。目前鑒定植物資源的方法主要有文獻(xiàn)考證、野外考察、標(biāo)本采集、品種的分類學(xué)鑒定以及DNA分子標(biāo)記等方法[10]。而DNA分子標(biāo)記是近年來(lái)使用最為廣泛的一種遺傳標(biāo)記形式，也是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和細(xì)胞標(biāo)記之后的一種較為理想的標(biāo)記方法，同時(shí)也是一種鑒定種質(zhì)資源較為有用的技術(shù)。它是以蛋白質(zhì)、核酸分子的突變?yōu)榛A(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)生物個(gè)體在基因或者基因型上所產(chǎn)生的變異來(lái)反映生物個(gè)體之間的差異[11]。DNA分子標(biāo)記包含限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)、序列標(biāo)簽位點(diǎn)技術(shù)(STS)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)技術(shù)(SSR)及單核苷酸多態(tài)性技術(shù)(SNP)等[12]，其中SSR分子標(biāo)記應(yīng)用較為廣泛。SSR分子標(biāo)記即微衛(wèi)星DNA，其序列串聯(lián)重復(fù)，并且主要分布于植物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)中，在分類水平上具有很好的保守性，并且具有突變速率快、多態(tài)性高、重復(fù)性好、能區(qū)分純合子和雜合子等特點(diǎn)，是一種理想的分子標(biāo)記[13]。蘋(píng)果SSR標(biāo)記主要基于二核苷酸重復(fù)序列進(jìn)行開(kāi)發(fā)[14]，SSR標(biāo)記通過(guò)基因組掃描技術(shù)(GSA)及譜系基因分型技術(shù)可以很好地覆蓋蘋(píng)果基因組[15]，前者主要用于繪制基因的抗性基因[16]，后者主要用于等位基因的挖掘以及對(duì)性狀關(guān)聯(lián)的評(píng)估[17]。由于不同物種的最佳SSR-PCR反應(yīng)體系不同，有必要對(duì)蘋(píng)果屬植物的SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化確定。

筆者以21種蘋(píng)果屬植物作為實(shí)驗(yàn)材料，采用L16正交實(shí)驗(yàn)對(duì)模板濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度以及Top Taq酶濃度等5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化改良，旨在為利用SSR分子標(biāo)記鑒定薔薇科蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2018—2019年在云南省云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)所采用的21種蘋(píng)果屬材料均采自云南省昭通市水果推廣站實(shí)驗(yàn)基地，詳見(jiàn)表1。利用隨機(jī)抽取的‘粉紅女士’品種的DNA作為SSR-PCR反應(yīng)優(yōu)化體系模板。引物設(shè)計(jì)參照Liebhard等[18]的研究，由擎科生物工程股份有限公司合成，詳見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)所用的dNTPs、Top Taq酶、DNAmarker，10×Top Taq buffer(Mg2+)以及6× DNA上樣緩沖液購(gòu)自云南金邦（普麥）生物科技有限公司(AP151-11)。

表1 21種蘋(píng)果屬植物

1.2 儀器設(shè)備

高速離心機(jī)(HC-2518)，供試PCR儀(Eppendorf AG 22331)，瓊脂糖凝膠電泳儀(DYCP-31DN)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(MGV-202-33)，切膠儀（天根生物科技有限公司），超微量分光光度計(jì)(tGem Spectrophotometer Plus)。

表2 引物序列

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

（1）DNA提取。方法參照Easy plant Genomic DNA kit（云科生物技術(shù)有限公司，code#E11101）。21種蘋(píng)果屬材料分別取0.1 g的嫩葉組織，液氮研磨后，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取，提取的DNA用65℃預(yù)熱的100 μL ddH2O溶解，-20℃保存。

（2）濃度檢測(cè)。通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。1 μL ddH2O進(jìn)行調(diào)零，檢測(cè)1 μL DNA待測(cè)液的濃度及OD260/OD280值，取OD值于1.8～2.0范圍內(nèi)的DNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 SSR-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)挑選‘粉紅女士’作為優(yōu)化體系的DNA模板，CH01h021作為引物，對(duì)表3中的引物濃度、Top Taq buffer(Mg2+)、dNTPs、Top Taq酶以及引物濃度等5個(gè)因素的4個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，L16(45)16個(gè)組合體系正交表結(jié)果如表4。反應(yīng)體系總體積為25μL，實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3.3 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

（1）PCR擴(kuò)增程序。94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，49～58℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取1μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入0.2μL DNA上樣緩沖液，分別用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳及8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

（2）產(chǎn)物檢測(cè)。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的條帶清晰度以及條帶的數(shù)量判斷模板濃度、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶濃度是否適合反應(yīng)體系；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶的清晰度來(lái)篩選引物。

1.3.4 最適SSR-PCR反應(yīng)溫度的篩選 參照何正文等[19]的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)條帶進(jìn)行判斷和篩選，其中特異性強(qiáng)、彌散度弱、條帶清晰的條帶視為正確擴(kuò)增條帶。根據(jù)擴(kuò)增正確條帶數(shù)判斷SSR-PCR反應(yīng)最適組合。

表3 SSR-PCR反應(yīng)體系因素及水平

表4 蘋(píng)果屬植物SSR-PCR反應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[L16(45)]

運(yùn)用最佳的SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，設(shè)置PCR反應(yīng)程序不變，將退火溫度設(shè)置49、52、55、58℃4個(gè)溫度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（根據(jù)引物的退火溫度設(shè)定），尋找最適退火溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 薔薇科蘋(píng)果屬品種DNA提取及濃度測(cè)定

對(duì)21個(gè)品種的DNA進(jìn)行提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有樣品的譜帶清晰明亮，無(wú)明顯雜質(zhì)，DNA完整性較好（圖1）。隨后通過(guò)DNA濃度和純度的測(cè)定，篩選出OD260/OD280值在1.8～2.0之間DNA樣品（表5）。

2.2 蘋(píng)果屬植物SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

隨機(jī)選取CH01h021作為引物（表2），根據(jù)表3中16個(gè)不同濃度梯度水平的組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(PAGE)。由SSR-PCR正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同組合的擴(kuò)增結(jié)果差異明顯，組合6、11、14下擴(kuò)增出的條帶數(shù)量多且條帶清晰明亮。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組合11、14所擴(kuò)增出的條帶清晰度較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定（圖2）。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)證明，組合14可作為最優(yōu)體系，即30～60 ng DNA模板、1.2μL正反向引物(5μmol/L)、0.5μL dNTPs(2.5 mmol/L)、0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5 μL 10×Top Taq buffer（含Mg2+），用ddH2O補(bǔ)至25μL。

為進(jìn)一步證明初步結(jié)論的準(zhǔn)確性，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的各因素及水平進(jìn)行分析（表6），其中K值代表在同一水平下所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的平均值，R值能夠反映某因素的極差，R值越大影響越顯著。通過(guò)對(duì)模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Top Taq酶濃度5個(gè)因素在4個(gè)水平內(nèi)的綜合分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)結(jié)果影響從大到小依次為引物濃度、Top Taq buffer(Mg2+)、模板DNA濃度、Top Taq酶及dNTPs。經(jīng)驗(yàn)證，上述實(shí)驗(yàn)中所獲得的SSR-PCR反應(yīng)體系為適合本實(shí)驗(yàn)的最適體系。

表5 21種蘋(píng)果屬植物品種的DNA濃度及OD值測(cè)定結(jié)果

圖1 薔薇科蘋(píng)果屬DNA質(zhì)量檢測(cè)電泳結(jié)果

圖2 正交設(shè)計(jì)SSR-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增（聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)）結(jié)果

2.3 最適退火溫度的篩選

引物的退火溫度對(duì)PCR結(jié)果的影響較大，為減少誤差，在以上反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行了篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退火溫度為52℃時(shí)，PCR擴(kuò)增出的條帶數(shù)目清晰（圖3）。

2.4 最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

為了檢測(cè)SSR-PCR反應(yīng)的穩(wěn)定性，隨機(jī)選用另外一對(duì)引物CH03d11進(jìn)行驗(yàn)證。以21種薔薇科蘋(píng)果屬品種DNA為模板，利用優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果條帶清晰，無(wú)拖帶并且大部分都具有2個(gè)或者3個(gè)等位基因，大小在100～200 bp左右（圖4），說(shuō)明該擴(kuò)增體系比較穩(wěn)定，可應(yīng)用于薔薇科蘋(píng)果屬植物SSR擴(kuò)增反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

SSR是基于特異性引物進(jìn)行PCR的分子標(biāo)記技術(shù)[20]，凡是影響PCR擴(kuò)增效果的因素，如Mg2+、DNA聚合酶、引物、模板DNA、dNTPs等，均會(huì)影響到SSR-PCR的結(jié)果。不同物種的SSR-PCR分析報(bào)道雖多，但大多是采取單因素梯度實(shí)驗(yàn)，過(guò)程復(fù)雜且不能兼顧各因素之間的相互影響[21-22]。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍治霾煌蛩刂g的交互作用[23]，同時(shí)也克服了單因素實(shí)驗(yàn)規(guī)模巨大、顧此失彼的問(wèn)題[24]，此種方法效率更高、穩(wěn)定性更好，能夠較為全面地找出各因素之間的規(guī)律[25]。因而本試驗(yàn)以此來(lái)獲得最優(yōu)反應(yīng)體系，減少SSR技術(shù)的誤差。

表6 SSR-PCR反應(yīng)體系的正交實(shí)驗(yàn)直觀分析

圖3 SSR-PCR反應(yīng)體系最佳退火溫度

圖4 SSR-PCR最佳反應(yīng)體系檢驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)研究前期參考Liebhard等[18]的研究，共選取了108對(duì)引物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)篩選出32對(duì)引物，本試驗(yàn)隨機(jī)挑選了其中的2對(duì)引物進(jìn)行后續(xù)的體系優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖凝膠電泳的條帶極易發(fā)生彌散拖尾現(xiàn)象，當(dāng)模板濃度過(guò)低時(shí)產(chǎn)物容易彌散；模板濃度過(guò)高時(shí)引物與dNTPs過(guò)早耗盡，結(jié)果不穩(wěn)定；引物濃度過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，極易形成引物二聚體[26-27]。PCR產(chǎn)物拖尾主要是由于退火溫度過(guò)低，當(dāng)退火溫度較低時(shí)容易出現(xiàn)條帶拖尾。通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在SSR-PCR反應(yīng)過(guò)程中，引物濃度的影響最為明顯，但模板濃度、dNTPs、Mg2+以及退火溫度也起到了較為關(guān)鍵的作用，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求靈活安排以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，將人為因素降低到最小。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，確定每個(gè)引物的最適退火溫度實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較繁瑣，本研究只列舉了引物CH03d11的退火溫度。當(dāng)采用多個(gè)引物同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)程序可采用降落PCR方法[28]，降落PCR能夠有效降低各組分濃度及退火溫度引起的非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，最終確定適用于薔薇科蘋(píng)果屬植物SSR-PCR的最適反應(yīng)體系為：30～60 ng DNA模板，1.2μL正反向引物(5μmol/L)，0.5μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5μL10×TopTaqbuffer（含Mg2+），用ddH2O補(bǔ)至25μL。該體系經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可用于后續(xù)薔薇科蘋(píng)果屬植物變異遺傳穩(wěn)定及分子身份證的構(gòu)建研究。