劉 航，魏長勇，余敏靈

(樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000)

甘草流浸膏是由甘草浸膏加工制成的流浸膏，收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部，標準對制劑中甘草酸采用以甘草酸銨為對照品的高效液相色譜法進行含量測定[1]，未對甘草苷含量進行控制，而甘草酸銨存在價格貴、易吸潮等缺陷。參照文獻[2-5]，本研究設計了以橙皮苷為對照品替代甘草酸銨，以色譜峰保留時間為輔，探索性地將紫外光譜特征和純度檢查因子應用于色譜峰定性中[6-9]。在定量分析中，通過測定橙皮苷和被測定物質(zhì)的相對校正因子(f值)，并運用f值計算甘草苷和甘草酸在制劑中的含量[10-13]。本實驗采用將對照品加入樣品溶液中的內(nèi)加入法，該法的使用將不再單獨測定對照品溶液，可降低儀器噪音和實驗操作對結(jié)果的影響，縮短了檢驗時間；與外標法測定數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 高效液相色譜儀(Agilent-1260)-DAD檢測器、OpenLAB CDS工作站(安捷倫科技有限公司)，高效液相色譜儀(Ultimate 3000)-DAD檢測器(賽默飛世爾科技公司)，高效液相色譜儀(PE-A10)-DAD檢測器(珀金埃爾默儀器有限公司)，UPT-Ⅱ-10T-優(yōu)普超純水器(成都優(yōu)普超純科技有限公司)，XSE205-電子天平(METTLER-TOLEDO公司)。

1.1.2試藥 甘草苷(批號：111610-201607，93.1%)、甘草酸銨(批號：110731-201720，97.7%)、橙皮苷(批號：110721-201818，96.2%)由中國食品藥品檢定研究院提供，甘草酸單銨鹽A原料由北京凱因科技股份有限公司提供(批號：1707003,67.2%)，甘草流浸膏由寶雞金森制藥有限公司(批號：620181206、620191001)和陜西富捷藥業(yè)有限公司(批號：2019070110、2019070210、2019080110、2018110210)提供。磷酸、三乙胺、甲醇均為分析純，乙腈為色譜純。

1.2方法

1.2.1溶液的制備

1.2.1.1對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品64.12 mg，置250 mL量瓶中，用甲醇(80%)溶解并定容，搖勻，作為貯備液A(橙皮苷)；精密稱取甘草苷對照品17.84 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇(80%)溶解并定容，搖勻，作為貯備液B(甘草苷)；精密稱取甘草酸銨對照品11.08 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇(80%)溶解并定容，搖勻，作為貯備液C(甘草酸銨)；分別精密量取貯備液A和貯備液B各1 mL，貯備液C 2 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇(80%)定容，搖勻，作為混合對照溶液(溶液D)。

1.2.1.2供試品溶液的制備 精密量取甘草流浸膏0.4 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇(80%)定容，搖勻，即得供試品溶液；另再精密量取甘草流浸膏0.4 mL，置50 mL量瓶中，精密加入貯備液A 5 mL，用甲醇(80%)定容，搖勻，即得橙皮苷-樣品混合溶液(溶液E)；以甲醇(80%)為空白溶劑。

1.2.2測定波長的選擇 提取溶液D色譜圖中橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨紫外圖，選擇吸收度適合、吸收曲線平緩的波長作為檢測波長。

1.2.3色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate LP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.1%三乙胺溶液(磷酸調(diào)pH值至2.5)為流動相(B)；檢測波長為276 nm(甘草苷)/284 nm(橙皮苷)/252 nm(甘草酸銨)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。梯度程序見表1。

表1 梯度程序

1.2.4專屬性試驗 量取1.2.1項的溶液D、溶液E、供試品溶液、空白溶劑10 μL，按1.2.3項的色譜條件測定，記錄色譜圖[14-15]。

1.2.5線性關系及f值的考察 按照1.2.3項色譜條件，取1.2.1.1項的溶液D 2、5、10、15、20、25、30 μL，注入色譜儀，校正截距為0，以峰面積(Y)與進樣量(X，μg)進行線性回歸，用甘草酸銨和甘草苷回歸曲線斜率分別與橙皮苷回歸曲線斜率的比值計算f值，本研究以Agilent 1260高效液相色譜儀、PE-A10高效液相色譜儀、Ultimate 3000高效液相色譜儀3臺不同液相色譜儀所測的平均值分別為最終f值。

1.2.6f值耐受性考察 按照1.2.3項色譜條件，取1.2.1.1項溶液D，采用不同高效液相色譜儀(共3臺)、不同波長(254/278/286、253/277/285、252/276/284、251/275/283、250/274/282 nm)、不同柱溫(31.0、30.0、29.0 ℃)、不同流動相pH值(2.9、2.7、2.5)、不同流速(1.005、1.000、0.995 mL/min)的條件進行測定，計算f值。

1.2.7紫外光譜穩(wěn)定性考察 取1.2.1.1項溶液D，照1.2.3項色譜條件除檢測波長外按照1.2.6項方法進行穩(wěn)定性考察，提取橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨紫外圖。

1.2.8精密度試驗 按照1.2.3項色譜條件，取1.2.1.1項溶液D，重復進樣6次，記錄相應色譜圖，計算6次進樣測定數(shù)據(jù)的相對標準偏差(RSD)。

1.2.9重復性試驗 取甘草流浸膏(寶雞金森制藥有限公司，批號620181206)0.4 mL 6份，按照1.2.1.2項方法制備溶液E，按照1.2.3項色譜條件測定，記錄色譜圖，計算6次進樣測定數(shù)據(jù)的RSD。

1.2.10穩(wěn)定性試驗 取1.2.1.2項的溶液E，室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h，按照 1.2.3項色譜條件測定，記錄色譜圖，計算各時間點進樣測定數(shù)據(jù)的RSD。

1.2.11回收率試驗 稱取甘草酸單銨鹽A(批號：1707003，67.2%)334.82 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇(80%)溶解并定容，搖勻，作為甘草酸單銨鹽A貯備液；取甘草流浸膏(寶雞金森制藥有限公司，批號：620181206，每毫升樣品中含甘草苷1.076 9 mg，含甘草酸23.083 1 mg)0.2 mL置于50 mL量瓶中，精密加入貯備液B和甘草酸單銨鹽A貯備液各2 mL，貯備液A 5 mL，用甲醇(80%)定容，搖勻，即得溶液F，平行制備6份，按照1.2.3項色譜條件，計算公式：Cm=(Am×Cs)/(f×As)計算，Cm為溶液F中甘草酸銨或甘草苷進樣量(μg)，Am為溶液F中甘草酸或甘草苷的峰面積，As為溶液F中橙皮苷峰面積，Cs為溶液F中橙皮苷進樣量(μg)。甘草酸含量為甘草酸銨含量乘0.979 7。

1.2.12樣品含量測定 取甘草流浸膏0.4 mL，按照1.2.1.2項方法制備溶液E和供試品溶液，按照1.2.3項色譜條件測定，記錄色譜圖，按1.2.11項方法計算被測定樣品中甘草酸銨和甘草苷進樣量，以進樣量計算每毫升樣品中甘草酸和甘草苷含量，將測定結(jié)果與外標法測定結(jié)果進行比較。

2 結(jié) 果

2.1測定波長選擇結(jié)果 甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨分別在276、284、252 nm波長處有最大吸收值。見圖1。故選擇測定波長為276 nm(甘草苷)/284 nm(橙皮苷)/252 nm(甘草酸銨)。

A.溶液D；B.溶液E。

2.2專屬性試驗結(jié)果 在溶液E色譜圖中有與溶液D色譜圖中橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨對應的色譜峰，被測定成分色譜峰與相鄰色譜峰分離度符合《中華人民共和國藥典》要求(均大于1.5)，供試品溶液中有與溶液D中甘草酸銨、甘草苷對應的色譜峰，沒有與溶液D中橙皮苷對應的色譜峰。以溶液D色譜圖中甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷色譜峰提取紫外圖譜建立相應的純度檢查圖庫，并與溶液E色譜圖中被測定成分色譜峰紫外圖譜相比，甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨色譜峰匹配因子分別為999.918/1 000、999.962/1 000、999.931/1 000。橙皮苷色譜峰與甘草苷和甘草酸色譜峰相對保留時間比值分別為1.339 2、0.539 6。溶液E和溶液D中橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨紫外光譜圖分別在284、276、252 nm波長處均有最大吸收值。見圖2。

A.空白溶劑；B.樣品溶液；C.溶液D；D.溶液E;1.甘草苷；2.橙皮苷；3.甘草酸銨。

2.3線性關系及f值考察結(jié)果 甘草苷、橙皮苷和甘草酸銨進樣量分別為0.033 2～0.498 3、0.049 3～0.740 2、0.433 0～6.495 1 μg具有較好的線性關系，回歸方程分別為Y=1 932.570 7X(r=0.999 5)、Y= 1 786.870X(r=0.999 2)、Y=803.233 3X(r=0.999 3)；甘草酸銨和甘草苷f值分別為0.449 2、1.081 4，RSD分別為0.22%、0.25%(n=3)。

2.4f值耐受性考察結(jié)果 不同液相色譜儀、柱溫、波長、流速、流動相pH值的f值均無顯著差異。見表2。

表2 f值耐受性考察結(jié)果

2.5紫外光譜穩(wěn)定性考察結(jié)果 在各色譜峰提取的紫外光譜圖中甘草苷、甘草酸銨、橙皮苷分別在(276±2)、(252±2)、(284±2)nm波長處有最大吸收值；以各對照物質(zhì)色譜峰提取的紫外圖譜建立自身對照紫外光譜圖庫，在各選擇的考察條件下，各組分色譜峰提取的紫外圖譜與各自自身對照紫外光譜圖庫比較，匹配因子均大于999.95/1 000。

2.6精密度試驗結(jié)果 橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨峰面積變化的RSD(n=6)分別為0.25%、0.34%、0.39%。

2.7重復性試驗結(jié)果 以每次測定橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的峰面積計算RSD(n=6)，分別為0.23%、0.47%、0.56%，表明重復性好。

2.8穩(wěn)定性試驗結(jié)果 甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷峰面積RSD(n=7)，分別為0.24%、0.19%、0.26%，室溫24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.9回收率試驗結(jié)果 甘草苷平均回收率為98.96%，RSD為1.42%，甘草酸銨平均回收率為97.67%，RSD為0.97%。見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.102種方法樣品含量測定數(shù)據(jù)比較 替代對照品法樣品含量測定數(shù)據(jù)與外標法比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 2種方法樣品含量測定數(shù)據(jù)比較

3 討 論

將替代對照品定量加入到樣品溶液中作為供試品溶液的內(nèi)加入法，按照實驗設計的色譜條件分析，加入替代對照品的樣品溶液與未加入替代對照品的樣品溶液色譜圖相比，在后者的色譜圖中不應有與替代對照品保留時間和位置一致的色譜峰。

因該樣品雜質(zhì)較多，色譜柱的改變，對相對保留時間具有影響，但對色譜峰定性時主要依據(jù)在相對保留時間相近的位置，通過與對照品色譜峰所建立的紫外純度檢測圖庫比較，同時按紫外特征吸收和匹配因子進行定性，所以，未考察不同色譜柱相對保留時間的影響。由于該工作站所建立的圖庫只適用于同類液相色譜儀，故該法在應用時存在較大局限性。

替代對照品內(nèi)加入法不需要單獨制備和測定對照溶液，簡化了操作程序，縮短了檢驗時間。由于該法同時測定對照品和樣品中的待測成分，所以，與外標法相比，該法可有效降低實驗過程和儀器噪音的影響，從而使相對保留時間更加穩(wěn)定，測定結(jié)果更準確。