田沛霖，張國林

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104)

胰島素是廣泛存在于人和動物體內(nèi)的多肽類激素，經(jīng)內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激，由胰臟內(nèi)的胰島B細(xì)胞分泌。主要用于調(diào)節(jié)糖代謝，是已發(fā)現(xiàn)的機(jī)體內(nèi)唯一可降低血糖的激素。胰島素在臨床上主要用于糖尿病治療。早期的胰島素主要從豬、牛等動物的胰臟中提取所得，存在濃度低、效期短和免疫原性強(qiáng)等缺陷，限制了其臨床使用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，通過重組DNA技術(shù)合成的人胰島素，不僅解決了上述問題，甚至可定向改變天然胰島素的氨基酸序列，從而獲得活性更高、作用時間更長、吸收更安全的胰島素類似物產(chǎn)品[1-2]。

重組人胰島素為重組技術(shù)生產(chǎn)的雙鏈多肽類激素，由51個氨基酸殘基組成，其中A鏈有11種(21個氨基酸)，B鏈有16種(30個氨基酸)，2條鏈通過2個二硫鍵相連，構(gòu)成具有活性的胰島素分子[3]。胰島素在歷年的《中國藥典》中均有收載，但在2015年版及更早版本中，N末端氨基酸序列未涵蓋在重組人胰島素的產(chǎn)品檢驗標(biāo)準(zhǔn)中。作為重組蛋白類藥物，其末端氨基酸殘基存在被酶切或降解的可能性，從而影響生物學(xué)功能[4]。當(dāng)胰島素氨基酸序列與理論序列一致時，可以作為判定產(chǎn)品結(jié)構(gòu)正確性、完整性以及穩(wěn)定性的重要依據(jù)。而在《中國藥典》(2020年版三部)人胰島素的3.3.12項涵蓋了“N末端氨基酸序列”[5]?？梢姡瑢χ亟M人胰島素原料藥的N末端氨基酸序列進(jìn)行測定，是其質(zhì)量控制的必要手段。

本研究旨在建立重組人胰島素原料藥N末端氨基酸序列的測定方法，為完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PPSQ-53A蛋白質(zhì)測序儀、LC-20AD高效液相色譜儀(HPLC,日本島津公司)；XSE205DU十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Lab Dancer小舞靈旋渦混合器(德國IKA公司)；微量移液器(德國Brand公司)；Wakopak?Wakosil PTH-GR硅膠柱(日本和光純藥工業(yè)株式會社)。

PTH-氨基酸混合物標(biāo)準(zhǔn)品(批號TWK5776)、R1溶液(5%異硫氰酸苯酯，正庚烷溶液，批號KCG0760)、R2GR溶液(30%N-甲基哌啶溶液，批號KCF20206)、R3溶液(三氟乙酸，批號KCM6143)、R4GR溶液(25%三氟乙酸溶液，批號KCF2027)、S2溶液(乙酸乙酯，批號KCG0691)、S3溶液(1-氯丁烷，批號KCK4251)、S4B溶液(37%乙腈，批號APE3239)、PTH-氨基酸洗脫液A[批號KCQ5445,成分：水(濃度<90%)、乙腈(濃度<15%)、醋酸銨(濃度<1%)、1-己烷磺酸鈉(濃度<1%)、醋酸(濃度<0.1%)]、PTH-氨基酸洗脫液B[批號KCQ5446,成分：水(濃度<60%)、甲醇(濃度28%)、2-丙醇(濃度14%)、醋酸(濃度<1%)],以上均購自日本和光純藥工業(yè)株式會社；聚凝胺試劑(polybrene,Sigma 試劑公司,批號SLBN6919V)；醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號20170728);超純水由Synergy制備;其余試劑為市售分析純。

1.2 供試品溶液的制備

重組人胰島素原料藥(美國禮來公司,批號C514759-1，純度經(jīng)測定為99.9%)為重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的由51個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，宿主為大腸桿菌。精密稱取該樣品適量，用1%醋酸溶液溶解稀釋，制成濃度約為50 μmol/L的溶液，即得。

1.3 PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備

取PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品1支，加入S4B溶液2 ml使其溶解，作為貯備液；取S4B溶液150 μl，加水450 μl渦旋混勻，作為稀釋S4B溶液；取貯備液10 μl，加稀釋S4B溶液490 μl，渦旋混勻，即得。

1.4 聚凝胺溶液的制備

取聚凝胺試劑1支，向配管內(nèi)注入750 μl蒸餾水(HPLC級)，振搖使完全溶解，即得(非立即使用時在低于-20 ℃條件下保存)。

1.5 分析條件

Edman降解后的PTH-氨基酸注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，用Wakopak?Wakosil PTH-GR硅膠柱，以PTH-氨基酸洗脫液A作為流動相A，以PTH-氨基酸洗脫液B作為流動相B；柱溫35 ℃，流速為0.3 ml/min，進(jìn)樣體積為50 μl，光電二極管陣列(PDA)檢測器，檢測波長為269 nm，按表1的條件進(jìn)行梯度洗脫。

表1 高效液相色譜儀洗脫條件

1.6 實(shí)驗操作步驟

1.6.1分析PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品

為了進(jìn)行HPLC分析系統(tǒng)的校準(zhǔn)，首先需對PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析。

量取“1.3”項下PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液90 μl，放置于指定樣品管內(nèi)并安裝封蓋。儀器將通過樣品管吸樣，以半自動方式進(jìn)行分析。分析其容量為50 μl。

所有檢測出的PTH-氨基酸峰，可通過比對PTH-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行識別并修正保留時間，從而獲得校準(zhǔn)后的各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)定位圖譜，確定分別為何種氨基酸。

1.6.2準(zhǔn)備玻璃纖維膜

待測的供試蛋白溶液需加在玻璃纖維膜上進(jìn)行分析反應(yīng)，因此必須預(yù)先對玻璃纖維膜進(jìn)行聚凝胺處理。

聚凝胺是一種多聚陽離子聚合物。在蛋白質(zhì)測序時，添加小劑量的聚凝胺能夠明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。而當(dāng)玻璃纖維膜中加入聚凝胺后，還能有效提高膜的親和性，從而更好地吸附樣品。

取“1.4”項下聚凝胺溶液15 μl，用微量移液器加到玻璃纖維膜上，干燥后進(jìn)行清洗處理，待用。

1.6.3樣品的序列分析

量取“1.2”項下供試品溶液5 μl，用微量移液器點(diǎn)在已經(jīng)過預(yù)處理的玻璃纖維膜上， 干燥后放入儀器指定位置，設(shè)置儀器參數(shù)開始序列分析，并對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果

2.1 PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測試結(jié)果

對PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品測試校準(zhǔn)了20種PTH-氨基酸的出峰時間。見圖1。

圖1 PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測試圖譜

2.2 重組人胰島素N末端氨基酸序列結(jié)果

運(yùn)行16個循環(huán)檢測重組人胰島素樣品N末端氨基酸殘基序列，前15個循環(huán)檢測到的氨基酸見圖2和表2。經(jīng)分析，重組人胰島素原料藥樣品N末端氨基酸的理論序列見表3。

2.3 實(shí)驗室比對結(jié)果

委托島津上海分析中心用PPSQ-53A蛋白質(zhì)測序儀在等度洗脫模式下，對該樣品的N末端氨基酸序列進(jìn)行了測序，PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測試圖譜見圖3。重組人胰島素供試品分析結(jié)果見圖4。

表3 重組人胰島素N末端理論氨基酸序列

圖3 PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測試圖譜(島津上海分析中心比對結(jié)果)

圖4 重組人胰島素N末端氨基酸序列完整圖譜(島津上海分析中心結(jié)果)

前15個循環(huán)檢測到的氨基酸種類分別為Gly、Phe；Ile、Val；Val、Asn；Glu、Gln；Gln、His；(Cys)、Leu；(Cys)、(Cys)；Thr、Gly；Ser；Ile、His；(Cys)、Leu；Ser、Val；Leu、Glu；Tyr、Ala；Gln、Leu，因此推斷樣品N末端氨基酸序列為A鏈Gly-Ile-Val-Glu-Gln-(Cys)-(Cys)-Thr-Ser-Ile-(Cys)-Ser-Leu-Tyr-Gln；B鏈Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-(Cys)-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。結(jié)果與重組人胰島素的理論氨基酸序列相符，實(shí)驗室比對結(jié)果一致。

3 討論

重組人胰島素是含有可高效表達(dá)人胰島素基因的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵、分離、高度純化、結(jié)晶和干燥制成[5]，是目前糖尿病治療的重要藥物之一。在《中國藥典》2020年版中，人胰島素等多個品種正式由過去的二部品種轉(zhuǎn)為三部品種，在三部中重組人胰島素通用名稱統(tǒng)一改為“人胰島素”。此外，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也與以往有較大的修訂。新增了N末端氨基酸序列等檢查項，“人用重組DNA蛋白制品總論”的3.1.1中也明確提示“一級結(jié)構(gòu)，即包括二硫鍵連接方式的氨基酸序列(包含二硫鍵的完整性和正確性、游離疏基)。應(yīng)盡可能采用綜合的方法測定目標(biāo)制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較”[5]?？梢?，這種一級結(jié)構(gòu)的特性分析是確保產(chǎn)品安全有效、建立并確定制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。作為驗證蛋白類藥物結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性的重要參數(shù)，N末端氨基酸序列的測定注定會越發(fā)普遍化，而這也為檢驗機(jī)構(gòu)的檢測能力提出了更新、更高的要求。

Edman降解是一種用于測定多肽和蛋白質(zhì)氨基端序列的經(jīng)典方法，其主要原理是通過異硫氰酸苯酯與蛋白質(zhì)或多肽的N末端殘基進(jìn)行偶聯(lián)、苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)環(huán)化裂解、噻唑啉酮苯胺(ATZ)轉(zhuǎn)化為苯異硫脲-氨基酸(PTH-氨基酸)等化學(xué)反應(yīng)，將氨基酸進(jìn)行特異性修飾[6]。每次循環(huán)時，都會從蛋白質(zhì)或多肽N末端裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的氨基酸進(jìn)行下一個Edman降解。所有生成的PTH-氨基酸會通過液相色譜(LC)進(jìn)行分析。而梯度洗脫的方式分離效果較好，能夠提高檢測的靈敏度[7]；等度序列分析則基線較平穩(wěn)，能提供更穩(wěn)定的保留時間。

本研究基于Edman降解原理，將樣品經(jīng)1%乙酸溶液處理后，采用PPSQ-53A蛋白質(zhì)測序儀依照序列切割N末端氨基酸后，注入高效液相色譜儀。使用Wakopak Wakosil?PTH-GR硅膠柱，通過梯度洗脫分離，PDA檢測器分析證實(shí)供試品N末端氨基酸序列與理論序列一致。本方法操作簡單、可行，能夠較好地實(shí)現(xiàn)重組人胰島素原料藥的氨基酸序列測定。但本方法也存在著一定的局限性，如樣品需要有比較高的純度[4]；N末端已發(fā)生修飾的蛋白難以進(jìn)行Edman反應(yīng)，因此當(dāng)雙鏈中有半胱氨酸時，由于結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸殘基會發(fā)生二硫鍵交聯(lián)而導(dǎo)致基團(tuán)封閉，無法與異硫氰酸苯酯發(fā)生偶聯(lián)，故而序列中的半胱氨酸無法檢測出[8-10]。

本實(shí)驗對樣品N末端氨基酸序列進(jìn)行分析時，是以液相圖譜中的出峰時間作為依據(jù)，即是在每一個循環(huán)中分別找出與PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間相一致的峰，從而加以確定。這種氨基酸匹配的方式，可能會因出峰時間的漂移而影響結(jié)果判斷，并且無法精確定位已檢測到的目標(biāo)氨基酸到底是源自A鏈還是B鏈。在本實(shí)驗的15個循環(huán)中，就有個別氨基酸峰的保留時間與混合標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間發(fā)生了偏離。因此，這只是一種半定性的方式，無法得到樣品的氨基酸絕對序列。

致謝：感謝島津上海分析中心對本實(shí)驗給予的幫助與支持。