（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園，南京 210014）

0 引言

甜菊糖苷（Steviol glycosides，SGs）是富含于菊科多年生草本植物甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）葉片中的多種四環(huán)二萜類化合物的總稱。因其具有高甜度、低熱量、預(yù)防和輔助治療肥胖癥、糖尿病、高血壓和高血糖等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于食品、飲料及醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。在目前發(fā)現(xiàn)的30余種糖苷組分中，蛇菊苷（Stevioside，STV）和萊包迪苷A（Rebaudioside A，RA苷）是甜葉菊葉片中糖苷的主要成分[2]，占總糖苷的80%～95%。相比于STV苷，RA苷甜度更高、口感更接近蔗糖，因此，RA苷具有更廣闊的市場前景[3-4]。

甜菊糖苷生物合成途徑及其關(guān)鍵基因挖掘一直是國內(nèi)外甜葉菊研究的熱點之一。目前已證實甜菊糖苷的生物合成是以甜菊醇（Steviol）為苷元，以尿苷二磷酸葡萄糖（Uridinediphosphate glucose，UDPG）為主要糖基供體，再經(jīng)一系列尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Uridinediphosphate-dependent glycosyltransferases，UGTs）的催化作用，分別在甜菊醇四環(huán)二萜苷的C-13 和C-19 位連接不同種類和數(shù)目的糖基而生成各糖苷組分[4]。STV苷是由甜菊雙糖苷在C-19位連接一個葡萄糖基轉(zhuǎn)化形成，而RA 苷是在STV苷的基礎(chǔ)上對其C-13位C-3′進行糖基化修飾而生成。在RA 苷合成過程中，SrUGT76G1 酶具有重要的催化作用[4，6]。GULERIA 等發(fā)現(xiàn)瞬時沉默SrUGT76G1基因?qū)е绿鹁仗擒蘸肯陆?6%～63%[7]。KIM 等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在甜葉菊中過表達SrUGT76G1后發(fā)現(xiàn)，總糖苷含量并沒有明顯變化，然而RA 與STV的含量比例由0.3 顯著上升為1.55，并且過表達SrUGT76G1不影響植株的生長發(fā)育過程[8]。本項目組前期對一超低RA 苷合成突變株的研究發(fā)現(xiàn)，該突變株糖苷合成異常是由于SrUGT76G1基因序列改變從而使相應(yīng)酶功能喪失所導(dǎo)致的[9]。SrUGT76G1酶的催化作用決定了RA苷的含量以及STV 苷和RA苷之間的比例，因此提高SrUGT76G1的表達對于糖苷產(chǎn)量和品質(zhì)的提高均具有重要意義。

植物次生代謝產(chǎn)物合成受多種因素調(diào)控，既包括外界環(huán)境因素（光照、水分、溫度和礦質(zhì)營養(yǎng)等），也包括內(nèi)在激素的調(diào)控，它們通過促進或者抑制糖苷合成路徑相關(guān)基因的表達進而影響甜葉菊葉片中糖苷合成[10]。前期研究表明，水分脅迫會影響RA 苷合成，但其分子作用機制尚未報道[11-12]。因此，本研究立足于RA 苷合成關(guān)鍵基因SrUGT76G1，通過熒光定量PCR、煙草瞬時轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理后GUS 染色等手段明確其對水分脅迫的響應(yīng)，并進一步分析SrUGT76G1啟動子中存在的可能與水分脅迫相關(guān)的順式作用元件。本研究為今后深入開展甜葉菊栽培的高效水分利用與管理措施提供理論支持，并為進一步鑒定SrUGT76G1上游響應(yīng)水分脅迫的調(diào)控因子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與種植條件

試驗所用的‘中山6號’甜葉菊植株保存于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所甜葉菊種質(zhì)資源圃。用于瞬時轉(zhuǎn)化的煙草植株和用于轉(zhuǎn)基因的野生型哥倫比亞擬南芥植株分別種植于營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1 和1∶1 的小方盆中，然后放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光周期為16 h 光照/8 h 黑暗，晝夜溫度為23 ℃/18 ℃，光照強度為80～100 μmol/(m2·s)，植物材料定期澆水，正常管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜葉菊、煙草和擬南芥植株水分脅迫處理

取生長一致的兩葉一心甜葉菊插穗扦插于營養(yǎng)土∶蛭石=1∶2的穴盤中，待生長至6片展開葉時從穴盤中移除，洗凈根，并放于培養(yǎng)箱中清水培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)條件與煙草和擬南芥植株種植條件相同。2 d后撤去清水，直接進行空氣干旱處理，并于撤去水后0、1、4、8、12 h 時分別取植株葉片，速凍于液氮中，然后保存在-80 ℃冰箱以備后續(xù)RNA 提取。將攜帶pUGT76G1:GUS載體的農(nóng)桿菌注入煙草葉片中，放置于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，并分別澆灌清水、15%和20% PEG（v/v）溶液，培養(yǎng)2 d 后取注射過的煙草葉片用于GUS 染色。將轉(zhuǎn)化pUGT76G1:GUS的擬南芥T3代純合株系播種于MS培養(yǎng)基上，生長2周后從培養(yǎng)基上小心取下，分別放置于含有0、200 mmol/L的甘露醇溶液中處理24 h，之后取出幼苗放于GUS染色液中進行染色。

1.2.2 RNA提取及基因定量

采用Trizol 試劑（TAKARA）進行甜葉菊和擬南芥總RNA 的提取，并通過PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TAKARA，D6110A）進行mRNA 的反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SrUGT76G1和甜葉菊內(nèi)參β-actin基因[13]的特異引物（引物序列見表1），通過SYBR Premix Ex Taq 試劑（TAKARA）在ABI7500熒光定量PCR 儀上對SrUGT76G1在不同水分脅迫時間點的表達量進行分析。相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法[14]。

表1 研究所用的PCR 引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.3 煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化

根據(jù)前期克隆得到的SrUGT76G1啟動子序列設(shè)計加接頭引物76G1-GUS-F/R（引物序列見表1），利用KOD 高保真酶（TAKARA）對目的序列進行擴增，通過Infusion 重組技術(shù)將膠回收后的目的片段插入到1305-GUS 載體中的EcoR1 和Nco1 酶切位點之間。構(gòu)建的pSrUGT76G1：GUS載體通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)菌株EHA105，經(jīng)菌液檢測正確后注射入生長五周左右的煙草健康葉片中并對注射區(qū)域進行標注。

1.2.4 GUS染色

將進行水分脅迫處理過后的煙草葉片和擬南芥轉(zhuǎn)基因幼苗放入GUS 染色液中（1 mg/mL X-Gluc、pH 7.0，1 mmol/L鐵氰化鉀，1 mmol/L 亞鐵氰化鉀，50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.1%Triton X-100，10 mmol/L EDTA、pH 8.0），用錫箔紙包裹后放置于37 ℃培養(yǎng)箱中。待組織著色后，用70%酒精進行多次脫色直至葉綠素完全褪去，然后放于純酒精中長期保存并拍照記錄。

1.2.5 擬南芥轉(zhuǎn)基因及陽性苗篩選鑒定

利用花粉管通道法將含有pSrUGT76G1:GUS載體的EHA105農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化入野生型擬南芥植株，并用保鮮膜包裹以保持濕潤。暗培養(yǎng)20～24 h 后打開保鮮膜，進行正常的管理直至收種[15]。收獲的種子用酒精進行清洗滅菌后播種于MS+20 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上。2周左右后將生長正常的陽性苗移栽到營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1 的培養(yǎng)基質(zhì)中，并用保鮮膜覆蓋1 周左右以保持濕潤。取陽性苗葉片進行RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄，并根據(jù)GUS序列設(shè)計引物（引物序列見表1），選取RT-PCR檢測為陽性的株系，繼續(xù)培養(yǎng)直至純合T3代。

1.2.6SrUGT76G1啟動子中水分脅迫響應(yīng)元件分析

將前期得到的SrUGT76G1啟動子序列提交到PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站，根據(jù)預(yù)測結(jié)果分析可能與水分脅迫相關(guān)的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

圖1 水分脅迫條件下SrUGT76G1基因表達模式Fig.1 The relative expression level of SrUGT76G1 gene under water stress conditions

2.1 水分脅迫下SrUGT76G1的表達模式分析

為了明確SrUGT76G1基因?qū)λ置{迫的響應(yīng)模式，對空氣干旱脅迫下SrUGT76G1的表達水平進行了定量分析。結(jié)果表明，隨著水分脅迫時間的延長，SrUGT76G1的表達水平呈現(xiàn)為先升高后下降的趨勢（圖1）。因此，SrUGT76G1的表達水平可能受水分脅迫嚴重程度的影響，即在輕度脅迫情況下表達上調(diào)，而重度脅迫則會抑制其表達。

2.2 SrUGT76G1啟動子轉(zhuǎn)化煙草干旱處理后GUS染色情況

為了進一步明確SrUGT76G1基因?qū)λ置{迫的響應(yīng)，我們構(gòu)建了pSrUGT76G1:GUS載體并等量注射入煙草葉片中，而后進行PEG 誘導(dǎo)的干旱處理。GUS 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照水分處理情況下的煙草葉片能被輕度染色，表明煙草體內(nèi)存在能夠結(jié)合SrUGT76G1啟動子的蛋白并啟動GUS報告基因的表達。然而，與對照相比，PEG 處理下的GUS 染色程度顯著增加，且20% PEG 處理作用要強于15%PEG（圖2）。以上結(jié)果證明，一定程度的干旱脅迫能夠增強SrUGT76G1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，這與干旱脅迫條件下SrUGT76G1表達量的變化情況相一致。

圖2 轉(zhuǎn)化pSrUGT76G1:GUS 載體的煙草干旱處理后GUS染色情況Fig.2 GUS staining of tobacco leaves transformed with pSrUGT76G1:GUS construct after drought treatment

2.3 SrUGT76G1啟動子轉(zhuǎn)化擬南芥干旱處理后GUS染色情況

為了更為深入地探究SrUGT76G1基因?qū)λ置{迫的響應(yīng)，我們進一步將上述pSrUGT76G1:GUS載體通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化入擬南芥哥倫比亞型野生型植株中。在抗性篩選培養(yǎng)基上獲得陽性苗后進一步利用RTPCR 方法對其進行檢測，并獲得多個陽性轉(zhuǎn)基因株系（圖3）。我們進一步選取陽性株系進行種植，進而得到多個T3代純合株系。選用#1 T3代幼苗，待其生長至2周后放置于含有0 和200 mmol/L 甘露醇的水溶液中培養(yǎng)24 h。GUS染色結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)甘露醇處理后的擬南芥幼苗染色程度明顯加深（圖4），與上述煙草中的結(jié)果相一致，進一步證實SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄活性確實可以受水分脅迫誘導(dǎo)。

圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR analysis detecting the GUS gene in WT and transgenic Arabidopsis

2.4 SrUGT76G1啟動子中干旱脅迫響應(yīng)元件分析

以上試驗結(jié)果表明，水分脅迫能夠誘導(dǎo)SrUGT76G1基因的表達。為了進一步探究其上游調(diào)控機制，將SrUGT76G1的啟動子序列提交PlantCARE 網(wǎng)站以進行順式作用元件的分析。預(yù)測結(jié)果表明，SrUGT76G1的啟動子中包含有多個茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif、MYC 和Myc）及脅迫相關(guān)的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序（圖5），暗示這些轉(zhuǎn)錄因子可能在水分脅迫條件下調(diào)控SrUGT76G1基因的表達。因此，后續(xù)擬構(gòu)建SrUGT76G1啟動子不同區(qū)段的GUS 載體，結(jié)合瞬時表達及轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理后GUS 染色情況進一步縮小水分脅迫響應(yīng)區(qū)段的啟動子序列，并結(jié)合元件預(yù)測和酵母單雜等手段進一步明確其上游調(diào)控因子。

圖4 pSrUGT76G1:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱處理后GUS染色情況Fig.4 GUS staining of pSrUGT76G1:GUS transgenic Arabidopsis after drought treatment

圖5 SrUGT76G1啟動子中干旱脅迫響應(yīng)元件分析Fig.5 The drought-responsive elements analysis of SrUGT76G1 promoter

3 討論

甜葉菊屬淺根系植物，具有對水分脅迫十分敏感的生物學(xué)特性，因此在目前實際栽培過程中，多予以較高土壤相對含水量（約為80%）以保持水分的充足供給[16]，而并沒有依據(jù)有益于甜葉菊生長和糖苷合成與品質(zhì)的實際水分需求進行灌溉，導(dǎo)致了大量水資源的浪費，且降低了干葉原料的品質(zhì)。目前，在藥用和香料植物中已多有報道稱，適量減少水分供給（抑或適度水分脅迫）在一定程度上可促進次生代謝產(chǎn)物的生成，然而，甜葉菊中的相關(guān)研究甚少。

次生代謝產(chǎn)物合成與水分脅迫之間的關(guān)系較為復(fù)雜，并受脅迫程度、持續(xù)時間、脅迫方式及物種類型等影響[17]。目前，已有較多研究表明適度水分脅迫可以促進次生代謝產(chǎn)物的合成，這是由于水分脅迫會誘導(dǎo)干旱相關(guān)的代謝反應(yīng)，例如氣孔關(guān)閉及CO2攝入顯著降低等，導(dǎo)致通過卡爾文循環(huán)固定CO2所需的還原當量消耗顯著降低，從而形成較大的氧化脅迫和還原當量過剩，此時植物的代謝過程就會轉(zhuǎn)向消耗還原當量的天然產(chǎn)物的合成過程[18]。BYTOF等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過干燥處理后的咖啡豆中的γ-氨基丁酸含量相比于未處理的提高約10倍[19]。在輕度水分脅迫下黃芪根中多糖和皂苷兩種次生代謝產(chǎn)物積累增加，使藥材質(zhì)量得到顯著提高[20]。在甜葉菊中，YANG 等通過停止?jié)菜敝撂鹑~菊植株萎蔫的方式進行干旱處理發(fā)現(xiàn)，RA 苷合成關(guān)鍵基因SrUGT76G1的表達水平顯著下調(diào)[11]。然而，KARIMI等通過間隔3、6、9 和12 d灌溉的方法使土壤相對含水量分別維持在90%、75%、60%和45%，測量甜葉菊株高、干葉重和糖苷含量后發(fā)現(xiàn)，當土壤相對含水量為60%時，株高和干葉重量相比于90%和75%條件下雖略有下降，但是總糖苷和RA 苷含量卻明顯升高，而當相對含水量降至45%時，植株生長發(fā)育則會受到明顯抑制，表明45%土壤相對含水量是供試甜葉菊品種的水分脅迫上限[12]。BEHROOZI 等在KARIMI等的試驗基礎(chǔ)上進一步發(fā)現(xiàn)，SrUGT76G1的表達量與RA 苷含量呈正相關(guān)，并且較90%和75%條件下有明顯的提高[6，10]。而本研究中SrUGT76G1的表達量隨著水分脅迫時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢則可以部分解釋以上結(jié)果的差異，即適度水分脅迫可以促進SrUGT76G1的表達而嚴重水分脅迫則抑制其表達。因此，本研究為今后提高甜葉菊栽培水分利用效率及提高RA 苷含量提供了重要的理論基礎(chǔ)。

近年研究證實，SrUGT76G1在RD 和RM苷合成過程中也具有重要作用[21-22]，該兩種糖苷成分的口感更為優(yōu)良，但其含量極少，只占干葉重的0.1%左右。因此，深入探究SrUGT76G1響應(yīng)水分脅迫的上游調(diào)控因子，不僅可以解釋適度水分脅迫促進RA 苷合成現(xiàn)象的分子機制，也為今后通過轉(zhuǎn)基因手段提高甜葉菊中優(yōu)質(zhì)糖苷的含量提供寶貴基因資源。

4 結(jié)論

（1）一定程度的水分脅迫可以促進RA 苷合成關(guān)鍵基因SrUGT76G1的表達。

（2）適度水分脅迫可能通過結(jié)合SrUGT76G1啟動子上的茉莉酸響應(yīng)和MYB轉(zhuǎn)錄因子順式作用元件來調(diào)控其表達。