賴小群，黃帝媛，姚瀟，陳悅佳，姚姿婷，鄒承武，陳保善

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；3.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004；4.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004)

0 引言

甘蔗（Saccharumspp.）是世界上最重要的糖料作物，全球食糖供應(yīng)總量的85%以上來自甘蔗，而在我國這一比例高達(dá)90%以上[1-2]。雜交育種是現(xiàn)代甘蔗品種選育的主流方法，除可以將父母本優(yōu)良性狀進(jìn)行組合外，還可能創(chuàng)造出超親雜種優(yōu)勢(shì)[3]。

新臺(tái)糖品種‘新臺(tái)糖25 號(hào)’具有高產(chǎn)、高糖、高抗黑穗病和條銹病等優(yōu)良特征[4-5]，而‘云蔗89-7’具有高產(chǎn)、高糖、抗倒伏、宿根性強(qiáng)、抗嵌紋病和褐條病等優(yōu)良性狀[6]。本研究團(tuán)隊(duì)利用‘新臺(tái)糖25號(hào)’ב云蔗89-7’這對(duì)親本組合雜交選育出的甘蔗新品種‘中蔗1 號(hào)’、‘中蔗6號(hào)’和‘中蔗9 號(hào)’，除了具有高產(chǎn)、高糖、耐寒和耐旱等優(yōu)點(diǎn)外，在抗黑穗病方面特別突出，新植和宿根蔗的黑穗病發(fā)病率都低于0.1%[7]。在上述中蔗系列品種選育過程中，觀察到‘新臺(tái)糖25號(hào)’ב云蔗89-7’親本組合的雜種后代除抗黑穗病性狀外，其他主要農(nóng)藝性狀如蔗糖分、株高、蔗莖、分蘗、株形、成熟期以及抗梢腐病等，均呈現(xiàn)一定程度的變異性。為充分發(fā)掘和利用‘新臺(tái)糖25 號(hào)’和‘云蔗89-7’的優(yōu)異基因資源，探究甘蔗抗/感黑穗病和梢腐病機(jī)理，本研究再次以‘新臺(tái)糖25 號(hào)’ב云蔗89-7’這對(duì)親本組合進(jìn)行有性雜交，通過構(gòu)建大規(guī)模遺傳群體來篩選特定性狀的遺傳亞群體，以便為今后利用多組學(xué)技術(shù)闡明甘蔗重要農(nóng)藝性狀形成的分子基礎(chǔ)提供研究材料。

甘蔗是雌雄同株高度雜合的異源多倍體植物，在雜交育種過程中如果母本去雄不徹底，將會(huì)發(fā)生自交現(xiàn)象，導(dǎo)致F1群體出現(xiàn)真雜種和自交種混雜現(xiàn)象，因此有必要對(duì)雜交后代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定。本研究的目的是篩選出多態(tài)性好的父本特異性的簡單串聯(lián)重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記用于對(duì)‘新臺(tái)糖25號(hào)’ב云蔗89-7’組合的F1代實(shí)生苗進(jìn)行真假雜種的鑒定，為利用真雜種構(gòu)建特定性狀亞群體奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：母本為‘新臺(tái)糖25號(hào)’，父本為‘云蔗89-7’，雜交組合花穂購自海南甘蔗育種場。親本及F1代實(shí)生苗種植于廣西扶綏縣廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)科新城甘蔗良種研發(fā)與繁育基地，常規(guī)管理。

供試藥品和試劑：Tris-HCl、EDTA、氯化鉀、丙烯酰胺、Tris 堿、硼酸、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED)、氫氧化鈉、硝酸銀、四硼酸鈉和甲醛等均為國產(chǎn)化學(xué)純或分析純等級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取

根據(jù)常規(guī)TPS 法[8]適當(dāng)改進(jìn)用于提取甘蔗總DNA。將約0.1 g 新鮮幼嫩葉片剪碎置于1.5 mL 離心管中，加入研磨珠和500μL TPS 緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、10 mmol/L EDTA（pH=8.0）、1 mol/L KCl]，置于研磨儀上，在振動(dòng)頻率為60 Hz（3 600 r/min）的條件下研磨60 s。75℃水浴20 min。12 000 r/min，離心l0 min。離心后，吸取200μL 的上清液加入到新的1.5 mL 離心管中并加入等體積異丙醇后混勻，4 000 r/min，離心，10 min。棄上清，在沉淀中加人120μL 的70%乙醇，4 000 r/min，離心5 min。沉淀置于室溫下干燥，干燥后加入50μL ddH2O溶解，置于-20℃保存待用。

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增

SSR 引物PCR 反應(yīng)體系總體積為20μL，每管包含10μL 2×Rapid Taq Master Mix，lμL 的模板DNA（15 ng/μL），上、下游引物各1 μL（10 pmolL）。在ABI ProFlexTM梯度PCR 擴(kuò)增儀（新加坡，ProFlex 3×32 孔）上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52～62 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)后再72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離或8%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，變性聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)銀染顯影后，拍照保存。

1.2.3 特異性目的片段的克隆測序

將聚丙烯酰胺凝膠上的目的條帶切下并搗碎，置于離心管中，加入適量超純水浸泡過夜，然后12 000 r/min離心1 min，取上清液（含目標(biāo)DNA）作為模板，用SMC31CUQ 引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，切取目的條帶并用膠回收試劑盒回收目的片段，然后克隆到pEASY?-T1 載體并進(jìn)行序列測定。TA克隆操作步驟詳見pEASY?-T1 Cloning Kit試劑盒說明書（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。DNA序列測定由生工生物工程（上海）有限公司完成。根據(jù)測序獲得的DNA序列信息設(shè)計(jì)特異性檢測引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

一對(duì)能在父本中擴(kuò)增出區(qū)別于母本的特征帶引物SMC31CUQ（圖1），是篩選自54對(duì)SSR引物（表1）。再利用這對(duì)引物對(duì)‘新臺(tái)糖25號(hào)’ב云蔗89-7’雜交F1代的部分實(shí)生苗進(jìn)行PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)部分樣本擴(kuò)增出具有母本特征的3 條帶（a，ROC25-1；b，ROC25-2 和c，ROC25-3），其余樣本擴(kuò)增出具有父本特征的4 條帶（d，YZ89-7-1；e，YZ89-7-2；f，YZ89-7-3 和g，YZ89-7-4），其中g(shù) 片段為父本‘云蔗89-7’所特有（圖2）。分別對(duì)這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行了回收、克隆和測序。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，全部7個(gè)PCR產(chǎn)物帶均攜帶完整的SMC31CUQ 引物序列SMC31CUQ-F 和SMC31CUQ-R，各產(chǎn)物序列具有高度同源性，是典型的重復(fù)性序列，但長度有所不同，主要表現(xiàn)為缺失，少量為插入突變（圖3）。為簡化鑒別程序和提高鑒定準(zhǔn)確性，根據(jù)‘云蔗89-7’特有的g片段（YZ89-7-4，159 bp）序列設(shè)計(jì)了一個(gè)3′端巢式引物SMC31CUQ-1-R（圖3），用其與SMC31CUQ-F 對(duì)父母本和部分F1代實(shí)生苗進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明該引物對(duì)僅能從父本和SMC31CUQ 檢測帶有g(shù) 片段的F1代實(shí)生苗（圖4A）特異性擴(kuò)增出一個(gè)約100 bp的產(chǎn)物，且能夠用普通瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（圖4B）。

圖1 部分SSR引物擴(kuò)增圖譜Fig.1 Amplification results of some SSR primers

表1 本研究所使用的SSR 引物序列Table 1 Sequences of the SSR primers used in the test

圖2 SMC31CUQ引物對(duì)親本及雜交F1代的SSR檢測結(jié)果Fig.2 The polymorphic bands of the primer SMC31CUQ for parents and its F1 progenies

圖3 親本的SMC31CUQ標(biāo)記序列比對(duì)及SSR引物和特異性引物結(jié)合區(qū)域Fig.3 Sequence alignment of SMC31CUQ marker from parents and the binding region of SSR and specific primers

圖4 用巢式SMC31CUQ-1-R進(jìn)行親本特征鑒定的特異性Fig.4 Specificity of nested primer SMC31CUQ-1-R on identification of parental characteristics

2.2 利用特異性SMC31CUQ-F/SMC31CUQ-1-R 引物對(duì)雜交后代進(jìn)行鑒定

取雜交組合‘新臺(tái)糖25號(hào)’ב云蔗89-7’的F1代遺傳群體的苗期葉片提取DNA，使用引物SMC31CUQ-F/SMC31CUQ-1-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從17 923 個(gè)樣品中鑒定出9 310 株具有父本特征條帶的子代，占總數(shù)的51.94%。

3 討論與結(jié)論

甘蔗是無性繁殖作物，雜種優(yōu)勢(shì)可以在F1代得到固定和利用[16]。在甘蔗雜交育種中，親本的選擇應(yīng)考慮基因遺傳效應(yīng)和自身表現(xiàn)[17]。由于甘蔗為異源多倍體植物，其雜交后代的基因自由組合和分離不一定符合孟德爾遺傳定律，同時(shí)某些性狀可能還受基因劑量調(diào)控，因此用遺傳群體來研究甘蔗重要性狀非常有必要。但要獲得足夠數(shù)量的單一性狀遺傳群體，首先要有大規(guī)模的F1群體。甘蔗穎花小，很難通過人工完全去雄，在甘蔗有性雜交育種過程中有可能發(fā)生自交，而且在雜交過程中也可能由于串粉而產(chǎn)生其他雜種材料，因此有必要對(duì)甘蔗雜交后代進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定[18]。在現(xiàn)有的多種甘蔗雜種真實(shí)性鑒定方法中，分子標(biāo)記方法可直接通過DNA 進(jìn)行鑒定，操作方便，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。而在多種分子標(biāo)記中，SSR 標(biāo)記因具有共顯性、高基因組覆蓋度、多態(tài)性高和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，已開始用于甘蔗雜交后代的真實(shí)性鑒定[9，15,19-20]。

本研究從54 個(gè)來源于不同甘蔗種質(zhì)資源的SSR 標(biāo)記中篩選出能在雜交組合‘新臺(tái)糖25 號(hào)’ב云蔗89-7’的F1代中擴(kuò)增出父本‘云蔗89-7’特征性DNA 片段的SMC31CUQ 標(biāo)記，并通過對(duì)所有父母本多態(tài)性片段的序列分析，成功建立了將父本特異性多態(tài)性片段轉(zhuǎn)化為特異性PCR 產(chǎn)物的方法，極大簡化了雜種鑒定程序。本研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)遺傳群體的51.94%（9 310株）攜帶父本標(biāo)記，可確定為真雜種。然而，由于甘蔗雜交存在父本染色體丟失現(xiàn)象，目前尚不能排除余下48.06%的F1群體是否仍然含有一定比例的真雜種。未來新的特異性SSR標(biāo)記或其他類型的標(biāo)記，將可望從對(duì)雜交親本的全基因組序列的對(duì)比分析中產(chǎn)生。

SSR標(biāo)記SMC31CUQ能在甘蔗親本品種‘新臺(tái)糖25號(hào)’和‘云蔗89-7’擴(kuò)增出有差異的多態(tài)性PCR 產(chǎn)物?；趯?duì)這些多態(tài)性PCR 產(chǎn)物的序列分析，新設(shè)計(jì)的SMC31CUQ-F/SMC31CUQ-1-R 引物對(duì)可在父本‘云蔗89-7’特異擴(kuò)增出一個(gè)114 bp 的PCR 產(chǎn)物，而在母本‘新臺(tái)糖25 號(hào)’不能擴(kuò)增任何片段。用該引物對(duì)雜交組合‘新臺(tái)糖25 號(hào)’ב云蔗89-7’的F1代遺傳群體17 923 個(gè)單株進(jìn)行檢測，其中51.94%（9 310 株）攜帶該父本標(biāo)記，可確定為真雜種，為甘蔗遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀的QTL定位等相關(guān)研究提供了可靠的材料。