練巧燕 陳奧 徐鑫 韋兵 蔡宇航 黃丹霞 何建行 巨春蓉

肺移植是治療終末期肺病的唯一有效手段。T淋巴細胞是介導(dǎo)排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞[1]，為預(yù)防排斥反應(yīng)，肺移植受者需終生服用針對T淋巴細胞的免疫抑制劑。但同時T淋巴細胞是抵御外界病原菌的“衛(wèi)士”[2]，過度抑制會導(dǎo)致感染的風(fēng)險增加[3]。正常機體內(nèi)，外周血CD3+CD4+T淋巴細胞與CD3+CD8+T淋巴細胞保持動態(tài)平衡，維持機體正常的細胞免疫功能。已有大量關(guān)于肝、腎移植術(shù)后T淋巴細胞亞群變化的研究報道，而關(guān)于肺移植術(shù)后受者T淋巴細胞亞群的數(shù)量及其動態(tài)變化的研究較少。本研究選取術(shù)后穩(wěn)定狀態(tài)（存活1年以上且術(shù)后1年內(nèi)未因急性排斥反應(yīng)及感染再次住院）的41例受者，分析其術(shù)后1年內(nèi)T淋巴細胞亞群的變化情況及影響因素，以了解肺移植受者的免疫狀態(tài)，為及時調(diào)整治療方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料及入組標準

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院移植中心自2016年1月至2019年3月共完成152例肺移植手術(shù)，根據(jù)納入和排除標準，選取41例術(shù)后穩(wěn)定狀態(tài)的受者為研究對象（圖1）。其中男31例，女10例，年齡28～69歲。單肺移植34例，雙肺移植7例。原發(fā)病分別為阻塞性肺疾病13例，限制性肺疾病26例，感染性肺疾病2例。根據(jù)國際心肺移植協(xié)會（International Society for Heart and Lung Transplantation，ISHLT）標準[4]，其中16例在術(shù)后72 h發(fā)生原發(fā)性移植物功能障礙（primary graft dysfunction，PGD）。

納入標準：（1）年齡>18歲；（2）供、受者ABO血型相同；（3）受者術(shù)前群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）陰性；（4）存活1年以上且術(shù)后1年內(nèi)未因排斥反應(yīng)或感染再次住院。

排除標準：（1）受者術(shù)前PRA陽性者；（2）多器官聯(lián)合移植或再次移植者；（3）骨髓或干細胞移植術(shù)后者；（4）因排斥反應(yīng)或感染再次住院者；（5）術(shù)后出現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（human immunode ficiency virus，HIV）感染或活動性肝炎、腫瘤者；（6）術(shù)后出現(xiàn)移植后淋巴組織增生性疾?。╬osttransplant lymphoproliferative disease，PTLD）者；（7）術(shù)后1年內(nèi)死亡以及診斷不明確、臨床資料不全者；（8）依從性差，不愿意配合檢查者。

圖1 41例肺移植受者入選流程Figure 1 The inclusion process of 41 lung transplant recipients

1.2 免疫抑制方案

單肺移植受者術(shù)中按體質(zhì)量予甲潑尼龍10 mg/kg靜脈滴注，雙肺移植受者術(shù)中予甲潑尼龍15 mg/kg靜脈滴注。所有肺移植受者均使用他克莫司或環(huán)孢素+嗎替麥考酚酯+潑尼松經(jīng)典三聯(lián)免疫抑制方案。

1.3 檢測方法

分別在手術(shù)前、術(shù)后2周及每個月（術(shù)后1年內(nèi)），采集肺移植受者清晨空腹靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝。檢測步驟如下：（1）取EDTA抗凝外周血100 μL加入流式細胞儀專用試管；（2）根據(jù)需要檢測的T淋巴細胞不同亞群，加入相應(yīng)的標記抗體各10 μL混勻，室溫避光孵育15 min；（3）加入紅細胞裂解液500 μL混勻，室溫避光放置10 min，待紅細胞裂解完全；（4）加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）500 μL 混勻，室溫避光平衡 5 min；（5）加入100 μL絕對計數(shù)微球，振蕩混勻；（6）將上述處理好的樣本加入FC500流式細胞儀進行檢測。應(yīng)用FLOWJO軟件分析，在前散射和側(cè)散射的二維Dot-plot圖上，根據(jù)細胞內(nèi)顆粒的密度及大小，選擇淋巴細胞區(qū)，按熒光強度自動測算選定區(qū)結(jié)合某單克隆抗體的陽性細胞比例和絕對值，并計算CD4+/CD8+比值。

1.4 研究內(nèi)容

分析肺移植受者術(shù)前及術(shù)后1年內(nèi)T淋巴細胞亞群絕對值及CD4+/CD8+比值的動態(tài)變化。通過閱讀文獻及臨床經(jīng)驗，分析受者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、手術(shù)方式、PGD發(fā)生情況及原發(fā)病對T淋巴細胞絕對值的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析及GraphPad Prism作圖。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)（四分位間距）表示。重復(fù)測量的縱向資料采用廣義估計方程進行分析，并以術(shù)后12個月為參考與其他時間點進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺移植受者術(shù)前及術(shù)后1年內(nèi)T淋巴細胞亞群絕對值及比值的變化趨勢

圖2 肺移植受者外周血T淋巴細胞亞群的檢測結(jié)果Figure 2 Detection results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of lung transplant recipients

圖3 肺移植受者術(shù)前及術(shù)后1年內(nèi)T淋巴細胞亞群的動態(tài)變化Figure 3 Dynamic changes of T lymphocyte subsets in lung transplant recipients preoperative and within 1 year after operation

流式細胞術(shù)檢測肺移植術(shù)后穩(wěn)定狀態(tài)受者T淋巴細胞亞群的結(jié)果如圖2。受者術(shù)前及術(shù)后1年內(nèi)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值及CD4+/CD8+比值的動態(tài)變化見圖3。結(jié)果顯示，受者術(shù)后1年內(nèi)，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值及CD4+/CD8+比值隨時間變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P<0.001）。CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對值在術(shù)后6個月內(nèi)短暫下降后逐漸上升，6～12個月隨時間變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P>0.05）；CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值在術(shù)后5個月內(nèi)逐漸上升，5～12個月隨時間變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。CD4+/CD8+比值在術(shù)后4個月內(nèi)短暫上升后逐漸下降，4～12個月隨時間變化的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與術(shù)前相比，術(shù)后12個月CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.659、0.109），CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值升高（P=0.02），而CD4+/CD8+比值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。

2.2 肺移植受者T淋巴細胞亞群絕對值動態(tài)變化的影響因素分析

采用廣義估計方程對41例肺移植術(shù)后穩(wěn)定狀態(tài)受者CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值變化的影響因素進行分析（表1）。結(jié)果顯示，受者的年齡、性別、BMI、手術(shù)方式以及術(shù)后是否發(fā)生PGD對CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值的動態(tài)變化無影響（均為P>0.05）。術(shù)前原發(fā)病對CD3+CD4+T淋巴細胞絕對值的變化無影響，但感染性肺疾病受者術(shù)后CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值較高（P<0.05）。

表1 T淋巴細胞亞群絕對值變化的影響因素分析Table 1 Influence factors analysis of the change of absolute value of T lymphocyte subsets

3 討 論

最早在1981年，美國科學(xué)家Cosimi等[5]發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值升高與腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)密切相關(guān)。目前研究已證實CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞在同種異體器官移植術(shù)后介導(dǎo)排斥反應(yīng)、抵御病原菌、誘導(dǎo)免疫耐受等方面發(fā)揮重要作用[6-7]。在心、肝、腎移植領(lǐng)域，國內(nèi)外已有大量關(guān)于T淋巴細胞亞群的研究，普遍認為外周血T淋巴細胞亞群可以反映受者的免疫狀態(tài)[8-12]。免疫抑制失衡導(dǎo)致的急性排斥反應(yīng)與感染是肺移植術(shù)后1年內(nèi)最主要的并發(fā)癥，可直接導(dǎo)致受者死亡，也是遠期并發(fā)慢性PGD的獨立危險因素[13-15]。過度免疫抑制還可引起腫瘤免疫監(jiān)控功能受損，導(dǎo)致肺移植受者惡性腫瘤的發(fā)生率增加[16-18]。ISHLT的數(shù)據(jù)顯示，肺移植受者術(shù)后1年生存率約為80%，平均中位生存期為6.7年，而生存期超過1年的受者中位生存期可達8.9年[19]。因此，準確把握肺移植受者術(shù)后1年內(nèi)的免疫抑制水平，不僅可降低急性排斥反應(yīng)和感染的風(fēng)險，還能提高肺移植受者的長期生存率。

Coiffard等[20]發(fā)現(xiàn)肺移植受者術(shù)后3～30 d外周血淋巴細胞總數(shù)、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞均呈下降趨勢，之后逐漸上升并在200 d到達平臺期。本研究回顧性分析了41例肺移植術(shù)后穩(wěn)定狀態(tài)受者1年內(nèi)外周血T淋巴細胞亞群的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值在肺移植術(shù)后早期（2周）下降，6個月內(nèi)隨時間逐漸恢復(fù)，6～12個月變化差異不大，與國外的研究結(jié)果基本一致[4,20-21]。由此可見，肺移植受者術(shù)后的免疫抑制程度并不是一成不變的，而是隨著免疫抑制方案的調(diào)整和時間的推移，逐漸達到免疫穩(wěn)態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺移植受者術(shù)后1年內(nèi)CD3+CD4+T淋巴細胞絕對值均低于術(shù)前，而CD3+CD8+T淋巴細胞絕對值在術(shù)后早期下降，隨之逐漸增加，術(shù)后12個月高于術(shù)前，導(dǎo)致CD4+/CD8+比值倒置。當外周血CD3+CD4+T淋巴細胞絕對值<200/μL時，感染率明顯升高，特別是特殊病原菌感染[4,22]。結(jié)合本研究結(jié)果，建議在肺移植術(shù)后早期，當CD3+CD4+T淋巴細胞絕對值<200/μL時適當降低免疫抑制強度。已有研究表明，肺移植受者外周血和小氣道內(nèi)CD3+CD8+T淋巴細胞的增多與肺移植術(shù)后閉塞性細支氣管炎綜合征的發(fā)生密切相關(guān)[18,23-25]。本研究中，肺移植受者術(shù)后外周血CD3+CD8+T淋巴細胞的升高是否與遠期（術(shù)后1年后）慢性PGD的發(fā)生相關(guān)，有待繼續(xù)跟蹤隨訪和進一步研究。

以往研究認為免疫誘導(dǎo)治療、年齡、體質(zhì)量、術(shù)前T淋巴細胞水平均可影響肺移植術(shù)后T淋巴細胞亞群的數(shù)量，年齡越大、體質(zhì)量越低，肺移植術(shù)后外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞下降越明顯[18,26]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后T淋巴細胞亞群的動態(tài)變化與受者年齡、BMI、手術(shù)方式以及術(shù)后是否出現(xiàn)PGD無關(guān)，可能與本研究樣本量較小，以及本移植中心經(jīng)驗性根據(jù)患者肺移植術(shù)前的狀態(tài)、年齡及免疫狀態(tài)調(diào)整了免疫抑制劑的用量相關(guān)。

綜上所述，肺臟是一個容易發(fā)生排斥反應(yīng)和感染的器官[27-30]，把握免疫抑制的平衡點至關(guān)重要。動態(tài)監(jiān)測外周血T淋巴細胞亞群的變化，有助于臨床醫(yī)師了解肺移植受者的免疫狀態(tài)，建議術(shù)后早期（1年內(nèi)）進行常規(guī)監(jiān)測。對于T淋巴細胞亞群絕對值及比值是否可作為肺移植受者調(diào)整免疫抑制劑的參考指標，有待后續(xù)進一步研究。