喬禹銘 周松 張亞 劉永光 趙明

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）是當(dāng)下熱點(diǎn)研究對象之一[1]，其廣泛應(yīng)用于組織工程、細(xì)胞移植、基因治療及器官移植等領(lǐng)域[2]。國內(nèi)外多項研究將外源BMSC移植到不同的動物模型體內(nèi)，探究其對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的多種疾病的治療效果。然而，BMSC的治療效果受到較多因素的限制，例如BMSC向受損組織歸巢率、局部缺氧和炎癥微環(huán)境下BMSC的存活率等。且BMSC的最佳移植劑量和移植方式仍有爭議。目前研究表明BMSC經(jīng)靜脈、動脈、局部注射途徑時，僅有一小部分BMSC能到達(dá)損傷組織，且存活率較低[3]。以激素、內(nèi)源性物質(zhì)、細(xì)胞因子等預(yù)處理BMSC或改良BMSC的應(yīng)用可以提高BMSC治療效果，是一種新的治療策略[4-6]。

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）可通過EPO受體促進(jìn)骨髓中紅細(xì)胞的生成，在臨床上廣泛應(yīng)用于各種貧血的治療。研究證實EPO具有部分非造血功能，其受體在腎臟細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞廣泛表達(dá)，表明EPO還可以起到廣泛的器官保護(hù)作用[7-10]。EPO預(yù)處理BMSC能否提高移植干細(xì)胞的治療效果成為了新的研究熱點(diǎn)。本研究通過體外細(xì)胞實驗探討EPO對大鼠BMSC增殖分化及遷移歸巢能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

Sprague-Dawley（SD）大鼠BMSC購自中國賽業(yè)生物公司，EPO購自沈陽三生制藥有限責(zé)任公司。四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒購自美國Sigma公司，CXC趨化因子受體（CXC chemokine receptor，CXCR）4購自美國Abcam公司。CXCR4蛋白的一抗為兔多克隆抗體，β-actin的一抗為兔單克隆抗體，二抗均為山羊抗兔多克隆抗體。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將BMSC接種到培養(yǎng)皿中，加入足量完全培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代至第5代BMSC用于后續(xù)試驗。增殖率測定、劃痕實驗、CXCR4蛋白測定：將第5代BMSC分為5組，分別為對照組（不加EPO）及10、100、500、1 000 IU/mL EPO組，加入EPO達(dá)到相應(yīng)的終濃度后共培養(yǎng)。表面標(biāo)志物測定、成脂分化和成骨分化、細(xì)胞骨架染色：將第5代BMSC分為BMSC組和EPO-BMSC組，EPO-BMSC組在BMSC培養(yǎng)液中加入EPO使之終濃度為500 IU/mL，BMSC組加入等量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），培養(yǎng)相應(yīng)時間。

1.3 研究方法

1.3.1 增殖率的測定 5組BMSC培養(yǎng)24 h和48 h后分別接種于6孔板中，每孔中加入20 μL MTT溶液孵育4 h，測定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.3.2 劃痕實驗 將5組BMSC培養(yǎng)48 h后接種于6孔板中，當(dāng)BMSC匯合達(dá)到80%～90%時，用移液槍槍頭在6孔板底部劃痕1次。倒置顯微鏡觀察BMSC的遷移情況。

1.3.3 CXCR4蛋白的測定 將5組BMSC培養(yǎng)48 h后接種于6孔板中，采用蛋白免疫印跡（Western blot）檢測各組BMSC中CXCR4蛋白的表達(dá)情況。因CXCR4與β-actin蛋白分子量接近，本研究采取先孵育CXCR4蛋白，洗脫之后再孵育β-actin的方法。

1.3.4 表面標(biāo)志物測定 將EPO-BMSC組和BMSC組的BMSC培養(yǎng)48 h后，兩組均分別加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記CD45、異硫氰酸熒光素（ fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 標(biāo) 記 CD90、CD44抗體，混勻后室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.3.5 成脂分化和成骨分化 EPO-BMSC組和BMSC組BMSC培養(yǎng)48 h后，添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成脂分化，分化12 d，待脂滴形成后進(jìn)行油紅O染色，蘇木素染液浸染1 min，倒置顯微鏡下觀察拍照；添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成骨分化，分化15 d，待礦化結(jié)節(jié)形成后，進(jìn)行硝酸銀染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 細(xì)胞骨架染色 EPO-BMSC組和BMSC組BMSC培養(yǎng)48 h后，3%多聚甲醛溶液固定，加入抗微管蛋白的一抗37 ℃孵育45 min，PBS沖洗后加入熒光標(biāo)記的二抗，熒光顯微鏡觀察微管染色情況；加入羅丹明-鬼筆環(huán)肽室溫避光反應(yīng)30 min后，顯微鏡下觀察微絲染色情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對于符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPO對BMSC增殖率的影響

培養(yǎng)24 h和48 h后，EPO對BMSC增殖率的影響見圖1。培養(yǎng)24 h后，對照組與10、100和500 IU/mL EPO組間BMSC的增殖率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P>0.05）。培養(yǎng)48 h后，與對照組比較，100 IU/mL和500 IU/mL EPO組BMSC的增殖率均提高（均為P<0.05）；與100 IU/mL EPO組比較，500 IU/mL EPO組BMSC的增殖率更高（P<0.05）。與對照組比較，1 000 IU/mL EPO組培養(yǎng)24 h和48 h后BMSC增殖率均降低（均為P<0.05）。

圖1 EPO對BMSC增殖率的影響Figure 1 Effects of EPO on proliferation rate of BMSC

2.2 EPO對BMSC遷移能力的影響

培養(yǎng)48 h后，EPO對BMSC遷移能力的影響見圖2。與對照組比較，100 IU/mL和500 IU/mL EPO組劃痕的距離明顯被修復(fù)，提示BMSC的遷移能力增強(qiáng)。

2.3 EPO對BMSC中CXCR4蛋白表達(dá)的影響

培養(yǎng)48 h后，EPO對BMSC中CXCR4蛋白表達(dá)的影響見圖3。與對照組比較，100 IU/mL和500 IU/mL EPO組中BMSC的CXCR4蛋白表達(dá)量升高，1 000 IU/mL EPO組BMSC中CXCR4蛋白表達(dá)量降低（均為P<0.05）。與100 IU/mL EPO組比較，500 IU/mL EPO組BMSC中CXCR4蛋白表達(dá)量更高（P<0.05）。

2.4 EPO對BMSC表面標(biāo)志物表達(dá)的影響

培養(yǎng)48 h后，EPO對BMSC表面標(biāo)志物表達(dá)情況的影響見圖4。結(jié)果顯示BMSC組和EPO-BMSC組BMSC均高表達(dá)CD90和CD44，不表達(dá)CD45。表明EPO不會影響B(tài)MSC表面標(biāo)志物的表達(dá)。

2.5 EPO對BMSC定向分化的影響

圖2 EPO對BMSC遷移能力的影響（×100）Figure 2 Effects of EPO on migration of BMSC

EPO對BMSC定向分化的影響見圖5。BMSC組和EPO-BMSC組BMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)15 d后，均可見紅色的礦化結(jié)節(jié)；經(jīng)成脂誘導(dǎo)12 d后，細(xì)胞中均出現(xiàn)較為明顯的圓形小脂滴，經(jīng)油紅O染色，可見紅色脂滴。表明EPO不會影響B(tài)MSC的定向分化。

圖3 EPO對BMSC中CXCR4表達(dá)水平的影響Figure 3 Effects of EPO on CXCR4 expression level in BMSC

2.6 EPO對BMSC細(xì)胞骨架形態(tài)的影響

培養(yǎng)48 h后，EPO對BMSC細(xì)胞骨架形態(tài)的影響見圖6。BMSC組中，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞骨架雜亂排列，無固定模式；但在EPO-BMSC組，大多數(shù)細(xì)胞的纖維骨架沿細(xì)胞的長軸排列，呈平行狀。

3 討 論

在不同的培養(yǎng)條件下，BMSC能夠高度增殖，并且通過誘導(dǎo)可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等組織細(xì)胞[11]。從骨髓中提取的BMSC集合了多種細(xì)胞的細(xì)胞群，即使來源一致，仍無法明確所提取的細(xì)胞中BMSC所占比例。因此，在實驗過程中，對BMSC進(jìn)行鑒定較為重要[12]。BMSC的鑒定內(nèi)容主要包括對其形態(tài)學(xué)特征、表面抗原、超微結(jié)構(gòu)及多向分化能力等的檢驗[13]。人類BMSC的鑒定標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下具有貼壁可塑性；（2）表達(dá) CD105、CD73、CD90，不表達(dá) CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19和人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR表面分子；（3）具有在體外分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的能力[14]。本實驗中，EPO-BMSC組和BMSC組BMSC的表面標(biāo)志物表達(dá)情況均為CD90和CD44陽性，CD45陰性；在成骨誘導(dǎo)中，兩組BMSC均可見紅色的致密結(jié)節(jié)出現(xiàn)，成脂誘導(dǎo)12 d后，可見紅色脂滴，表明EPO與BMSC共培養(yǎng)后，EPO并沒有影響B(tài)MSC的定向分化。

圖4 EPO對BMSC表面標(biāo)志物表達(dá)的影響Figure 4 Effects of EPO on expression of surface markers of BMSC

圖5 EPO對BMSC定向分化的影響Figure 5 Effects of EPO on directional differentiation of BMSC

圖6 EPO對BMSC細(xì)胞骨架形態(tài)的影響（免疫熒光，×400）Figure 6 Effects of EPO on cytoskeletal morphology of BMSC

越來越多的研究證實了BMSC移植治療各種疾病的安全性、可行性和有效性。國內(nèi)已經(jīng)有學(xué)者在腎移植手術(shù)過程中經(jīng)移植腎動脈輸注BMSC，手術(shù)順利，術(shù)后未發(fā)生栓塞、感染等并發(fā)癥，并且受者術(shù)后均采用低劑量免疫抑制方案，也未發(fā)生排斥反應(yīng)，術(shù)后移植腎功能恢復(fù)良好[15]。但BMSC移植治療的效果仍受到較多因素限制，如BMSC向受損組織歸巢率、局部缺氧和炎癥微環(huán)境下BMSC的存活率等[16]。有研究者將間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢作用定義為間充質(zhì)干細(xì)胞在目標(biāo)組織的脈管系統(tǒng)中被捕獲，穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至目標(biāo)組織的過程[17]。許多學(xué)者認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢作用類似于白細(xì)胞向炎癥組織遷移的過程，與細(xì)胞表面表達(dá)趨化因子和生長因子等受體有關(guān)，目前研究最多的是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）、CXCR、黏附因子等[18-22]。CXCR4是一種重要的趨化因子受體，可與配體SDF-1結(jié)合，是參與BMSC遷移歸巢的主要信號通路[23]。Liu等[24]將BMSC輸注到急性腎損傷小鼠體內(nèi)，結(jié)合EPO皮下注射，可使受損腎組織SDF-1蛋白表達(dá)升高，并且BMSC在腎臟組織聚積的數(shù)量也增加。也有研究顯示在一定濃度范圍內(nèi)，EPO可促進(jìn)BMSC增殖，且與濃度大小呈依賴關(guān)系[25]。本實驗結(jié)果顯示，EPO與BMSC共培養(yǎng)48 h后，100、500 IU/mL EPO可促進(jìn)BMSC增殖。此外，我們發(fā)現(xiàn)與對照組比較，100、500 IU/mL EPO組中BMSC的CXCR4表達(dá)量增加；EPO處理后的BMSC纖維骨架沿細(xì)胞的長軸排列，呈平行狀，該細(xì)胞骨架形態(tài)表明BMSC遷移能力增強(qiáng)[26]。

綜上所述，EPO可提高BMSC的遷移率、增殖能力和組織修復(fù)治療能力，可能通過增加CXCR4的表達(dá)促進(jìn)其向損傷器官組織的定向歸巢。EPO作為BMSC的預(yù)處理因素具有良好的應(yīng)用前景，這仍需進(jìn)一步的動物模型，甚至大規(guī)模的臨床實驗進(jìn)行探索。