錢 蓉，陳衛(wèi)民，柴紅梅，陶 南，趙永昌，陳玉惠

（1西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650221；3云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223；4農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223）

0 引言

擔(dān)子菌中存在多種有性孢子，包括同核體和異核體，具有兩個(gè)或多個(gè)異核體萌發(fā)的菌絲體能完成正常的有性生殖過(guò)程，而同核體結(jié)實(shí)是一種比較異類的生殖方式，曾在多種擔(dān)子菌中此現(xiàn)象[1]，包括暗絨蓋多孔菌(Polyporus ciliatus)[2]，光滑環(huán)銹傘(Pholiota nameko)[3]，和裂褶菌(Schizophyllum commune)[4]等，金針菇(Flammulina velutipes)[5]產(chǎn)生的子實(shí)體多為流產(chǎn)型結(jié)實(shí)(Abortive homokaryotic fruiting,AHF)和真同核體結(jié)實(shí)(True homokaryotic fruiting,THF)，前者(AHF)子實(shí)體不開(kāi)傘也不產(chǎn)生孢子，而后者(THF)產(chǎn)生的子實(shí)體發(fā)育完全但較小，孢子梗上多著生2個(gè)孢子。有趣的是茶樹(shù)菇(Agrocybe aegerita)中單核體能產(chǎn)生第3種子實(shí)體類型即假同核體結(jié)實(shí)(Pseudo homokaryotic fruiting,PHF)，其初生菌絲具鎖狀聯(lián)合，而且子實(shí)體發(fā)育完全，擔(dān)子上著生4種交配型的孢子[6]。由此可見(jiàn)，擔(dān)子菌產(chǎn)孢類型多變，容易混淆研究者對(duì)于物種遺傳模式的認(rèn)識(shí)。

根據(jù)已有的遺傳模式研究，茶樹(shù)菇有性生殖遺傳分為兩種類型。（1）典型四極性異宗結(jié)合型：研究分析了歐洲和日本的野生菌株交配型后認(rèn)為茶樹(shù)菇為多等位基因控制的四極性交配型[7-8]。（2）同核體交配極性轉(zhuǎn)換型：從茶樹(shù)菇中分離了4株野生型菌株子代，經(jīng)鎖狀聯(lián)合觀察和交配極性測(cè)試，確認(rèn)后的同核體菌株進(jìn)行出菇分析，結(jié)果顯示同核體菌株能產(chǎn)生3種類型的子實(shí) 體 AHF(Abortive homokaryotic fruiting)、THF(True homokaryotic fruiting)和PHF(Pseudo-homokaryotic fruiting)型，其中PHF型子實(shí)體的后代中產(chǎn)生兩種新的交配型，后期的驗(yàn)證表明單核體菌株中進(jìn)行了自發(fā)的極性轉(zhuǎn)換[6]。單核體產(chǎn)生子實(shí)體的比例超過(guò)50%，個(gè)別菌株達(dá)到100%，THF和PHF的比率約為40%。經(jīng)過(guò)子代交配型分析，研究者推斷茶樹(shù)菇交配極性轉(zhuǎn)換菌株中A和B交配位點(diǎn)分別有3個(gè)，其中2個(gè)為沉默表達(dá)位點(diǎn)[6]。當(dāng)二者通過(guò)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移，交配基因具有活性時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)新的交配極性。由此可見(jiàn)，茶樹(shù)菇單核體生殖是一種普遍現(xiàn)象，揭示其交配位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)組成及交配特征對(duì)于分析茶樹(shù)菇交配極性轉(zhuǎn)化具有重要的作用。

真菌的交配系統(tǒng)中，由單個(gè)遺傳因子A決定的稱為二極性交配系統(tǒng)，四極性交配系統(tǒng)則由不連鎖的A、B雙因子控制[11-12]。其中B因子編碼信息素及其受體，控制著鎖狀細(xì)胞的融合和核遷移過(guò)程[13-14]。信息素及其受體蛋白，通過(guò)細(xì)胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)受體觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)生化反應(yīng)，進(jìn)而完成整個(gè)的生活史[15-17]。多級(jí)聯(lián)的磷酸化反應(yīng)最終將信號(hào)傳遞到末級(jí)的功能蛋白，控制著細(xì)胞融合等生理過(guò)程[18]。前期研究顯示茶樹(shù)菇近緣種楊柳田頭菇Agrocybe salicacola中B交配位點(diǎn)具有5個(gè)受體基因和2～3個(gè)信息素前體編碼基因，并且該位點(diǎn)被完整遺傳給子代[9]，該結(jié)果與前期研究中推測(cè)茶樹(shù)菇中具有3個(gè)B交配位點(diǎn)的結(jié)果不同。由于前期研究中，研究者僅對(duì)茶樹(shù)菇交配特點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，沒(méi)有從交配位點(diǎn)分子組成進(jìn)行進(jìn)一步闡述。因而，本研究擬以茶樹(shù)菇Y(jié)SG菌株為研究材料，通過(guò)分離同核體菌株，進(jìn)行基因組測(cè)序，驗(yàn)證分析其B交配位點(diǎn)，結(jié)合子代同核體交配基因分布和交配型分析，為茶樹(shù)菇的有性生殖研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年9月—2018年10月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株茶樹(shù)菇Y(jié)SG菌株來(lái)源于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，菌株屬性見(jiàn)前文描述[10]。

1.3 同核菌株分離及菌株配對(duì)分析

單孢菌株分離采用孢子稀釋涂布法，挑取的菌株轉(zhuǎn)移到Y(jié)PD培養(yǎng)基（酵母提取物2 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH值自然）上。培養(yǎng)2周根據(jù)菌落的整齊度初步篩選，選取邊緣整齊菌株進(jìn)行顯微鏡觀察，并依據(jù)鎖狀結(jié)構(gòu)判斷菌株是否為同核體。獲得的同核體菌株采用采用對(duì)峙培養(yǎng)的方法分析菌株交配極性。子實(shí)體形態(tài)切片后在顯微鏡下進(jìn)行顯微形態(tài)觀察。

1.4 菌株培養(yǎng)及DNA提取

菌絲體置于YPD培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2周后，刮取1 g菌絲液氮研磨后使用真菌DNA提取試劑盒(Biomega)提取基因組DNA。菌絲塊接到無(wú)菌的木屑培養(yǎng)基（木屑80%，麥麩19%，石灰1%），置于22℃培養(yǎng)，用于出菇觀察。

1.5 引物特征及PCR擴(kuò)增

依據(jù)前期獲得YSG同核體子代菌株YS8基因組注釋結(jié)果，獲得B交配位點(diǎn)，根據(jù)序列特征設(shè)計(jì)引物，用于驗(yàn)證序列。本試驗(yàn)所用引物的合成及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定均在昆明碩擎生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 YSG菌株子代同核出菇特征

同核體菌株接到木屑培養(yǎng)基后，進(jìn)行了子代同核體出菇實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，同核體能夠形成不同類型的子實(shí)體，包括菌絲型（只有濃密的菌絲）、無(wú)蓋型（無(wú)菌蓋）和菌柄型（經(jīng)過(guò)顯微觀察，菌蓋不發(fā)育，不產(chǎn)生孢子）（圖1）。其中的無(wú)蓋型和菌柄型子實(shí)體在形成小的菇體后不再繼續(xù)生長(zhǎng)，之后就被菌絲覆蓋后凋亡。

2.2 B交配位點(diǎn)結(jié)構(gòu)組成分析

選擇YSG菌株子代同核體菌株YS8（交配型A1B1）進(jìn)行基因組測(cè)序及組裝。根據(jù)基因組注釋信息，并設(shè)計(jì)5對(duì)嵌套引物YS8RCB1f/1r-YS8RCB5f/5r進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證B交配位點(diǎn)序列的準(zhǔn)確性（表1）。結(jié)果顯示，YS8菌株的B交配位點(diǎn)分別被組裝到2個(gè)Scaffold上，包括4個(gè)完整的信息素受體和1個(gè)信息素前體編碼基因（圖2A）。

進(jìn)一步的序列分析發(fā)現(xiàn)，以上2個(gè)Scaffold上靠近信息素受體基因B2-rcb2和B2-rcb4區(qū)域，分別有一個(gè)片段被注釋為信息素受體編碼基因，二者（分別命名為B2-rcb3a和B2-rcb3b）的下游和上游分別約有30 kb和20 kb以上的區(qū)域內(nèi)沒(méi)有信息素受體基因存在。并且緊鄰區(qū)域部分序列反向互補(bǔ)（圖2B）。將2個(gè)片段拼接到一起后，能夠組成完整的信息素受體編碼基因（圖2C）。

2.3 同核體子代基因型及交配型分析

根據(jù)2個(gè)片段B2-rcb3a和B2-rcb3b序列，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)P3af/r和P3bf/r（表2），用來(lái)分析同核體群體子代基因型。擴(kuò)增結(jié)果現(xiàn)實(shí)，2對(duì)引物將所有的同核體菌株分為2種類型，并且二者的擴(kuò)增譜相同（圖3A），推測(cè)連接B2-rcb3a和B2-rcb3b的大片段區(qū)域，在遺傳到子代的過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生重組。

圖1 同核體菌株出菇特征

表1 YS8菌株B交配位點(diǎn)驗(yàn)證及交配型鑒定引物特征

交配型分析結(jié)果顯示，所用的同核體菌株群體只有2種B交配型，分別為b1和b2型（圖2B）。交配型與B交配基因的基因型呈現(xiàn)完全對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而也進(jìn)一步表明了B交配位點(diǎn)決定了菌株的交配型，并且該位點(diǎn)被完整分配到子代中。

3 討論

明確真菌的有性生殖模式和交配因子組成，對(duì)于其生殖遺傳研究、子實(shí)體發(fā)育，以及育種研究都具有重要意義。交配位點(diǎn)的基因組成決定了菌株的交配特點(diǎn)，探究真菌物種的有性生殖特征，需要明確其交配位點(diǎn)結(jié)構(gòu)組成。有關(guān)B位點(diǎn)基因遺傳結(jié)構(gòu)組成的研究較多，其組成也更為復(fù)雜，被認(rèn)為是真菌在野生狀態(tài)下提高交配成功率的一種生存策略[12,19]。灰蓋鬼傘Coprinus cinereus B交配位點(diǎn)有3個(gè)基因簇，每個(gè)由3個(gè)基因組成，負(fù)責(zé)編碼2個(gè)信息素和1個(gè)受體[19]。隨著基因組學(xué)的廣泛應(yīng)用，更多真菌的基因組得以快速解析。香菇Lentinula edodes B交配位點(diǎn)內(nèi)有4個(gè)受體編碼基因及兩個(gè)信息素前體，并且在單核體中B位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基本一致[21-22]。金針菇包含有兩個(gè)亞位點(diǎn)，分別有一個(gè)信息素受體和1～2個(gè)信息素前體編碼基因[23]。草菇Volvariella volvacea中具有4個(gè)信息素受體編碼基因[24]，但其B交配位點(diǎn)可能沒(méi)有活性[25]。本研究中所確定的茶樹(shù)菇Y(jié)SG菌株B交配位點(diǎn)包含有5個(gè)信息素受體和1個(gè)信息素前體編碼基因，與之前報(bào)道的近緣種楊柳田頭菇相似[9]。由此可見(jiàn)，在明確不同物種中交配基因的組成，以及多個(gè)信息素及受體在同核體菌株交配過(guò)程中的作用，才能探究交配極性轉(zhuǎn)換的機(jī)制。但是由于目前對(duì)交配基因功能的認(rèn)識(shí)不足，因而對(duì)茶樹(shù)菇B位點(diǎn)結(jié)構(gòu)組成的命名比較模糊，如亞位點(diǎn)的劃分只是根據(jù)信息素及其受體編碼基因簇的聚集度，即它們?cè)诨蚪M物理圖譜上的距離來(lái)進(jìn)行，而不是依據(jù)其交配功能來(lái)劃分。茶樹(shù)菇B交配位點(diǎn)信息素和其受體在基因上距離較小，似乎只能認(rèn)定為一個(gè)位點(diǎn)，判斷比較困難。以前報(bào)道中所認(rèn)為的茶樹(shù)菇應(yīng)有3個(gè)亞位點(diǎn)[6]，筆者建議這些亞位點(diǎn)應(yīng)該描述為功能基因，即它們決定交配功能角色的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了新的交配極性的產(chǎn)生。另外，通過(guò)茶樹(shù)菇Y(jié)SG同核體子代B交配位點(diǎn)和交配型分析，明確了其決定菌株交配型，并且在遺傳給子代的過(guò)程中，B位點(diǎn)內(nèi)部沒(méi)有重組事件發(fā)生。該結(jié)果表明了該位點(diǎn)組成發(fā)生改變的幾率較小，即使如本研究中發(fā)現(xiàn)的大片段插入也沒(méi)有改變?cè)撐稽c(diǎn)整體遺傳到子代現(xiàn)象出現(xiàn)。在本研究中，分離了大量的同核體，培養(yǎng)結(jié)果只獲得了部分畸形（或不產(chǎn)孢型）子實(shí)體，而并未得到正常子產(chǎn)孢型實(shí)體，這與文獻(xiàn)報(bào)道中高比率產(chǎn)孢同核體相比明顯不同，結(jié)果的差異是否由于類群差異造成，由于茶樹(shù)菇類群較多[26-28]，還需要收集更多的資源，并根據(jù)類群劃分進(jìn)行同核體出菇分析。

圖2 B交配位點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征

圖3 同核體子代B交配位點(diǎn)基因型及交配型

4 結(jié)論

茶樹(shù)菇Y(jié)SG子代同核體培養(yǎng)后，部分菌株能產(chǎn)生子實(shí)體，但缺少菌蓋或有菌蓋但無(wú)擔(dān)子，即產(chǎn)生的畸形子實(shí)體沒(méi)有經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程。根據(jù)基因組序列，獲得了YSG子代同核體YS8菌株B交配位點(diǎn)信息，經(jīng)嵌套PCR驗(yàn)證確認(rèn)B交配位點(diǎn)包含有5個(gè)信息素受體和一個(gè)信息素前體編碼基因。其中B2-rcb3基因序列中有一個(gè)大于50 kb的插入片段，該片段中有部分序列為反向重復(fù)。經(jīng)過(guò)子代同核體PCR擴(kuò)增譜分析，表明B交配位點(diǎn)，包括該大的插入片段并未在有性生殖過(guò)程中發(fā)生重組，而是完整的遺傳到子代中。交配極性分析結(jié)果顯示，群體中只有2種B交配型，24個(gè)菌株中沒(méi)有新的B交配型產(chǎn)生，并且也印證了B交配位點(diǎn)完整遺傳到子代的特征。這些結(jié)果與以前報(bào)道的茶樹(shù)菇交配極性轉(zhuǎn)換結(jié)果不同，有助于茶樹(shù)菇生殖遺傳多樣性及育種工作研究。