王瑞雪 劉佳森 李蘊華 成立新 岳林芳 馬萬山 趙艷紅

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

lncRNA作為2012年度新興起的生命科學(xué)研究之一[1]，在生物眾多生命活動中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，是繼mRNA和miRNA之后最熱門的分子生物學(xué)研究領(lǐng)域之一。lncRNA 是一類長度均>200 nt且不具備或很少具有蛋白質(zhì)編碼能力的 RNA[2]，并缺乏明顯的開放閱讀框。最初有研究認(rèn)為 lncRNA 是基因組轉(zhuǎn)錄過程中形成的“噪音”，在生物體內(nèi)不發(fā)揮任何生物學(xué)功能[3]。但近期的研究表明，lncRNA可參與細胞核和細胞質(zhì)中的 X 染色體失活、染色體結(jié)構(gòu)改變、基因印記、轉(zhuǎn)錄激活/沉默和核內(nèi)運輸?shù)汝P(guān)鍵生命活動[4]。Cesana等[5]通過研究人和小鼠的骨骼肌生長發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，特異性表達的長鏈非編碼 RNA linc-MD1可以結(jié)合miR-133和miR-135來調(diào)控肌肉特異性基因MAML1和MEF2C的表達。Zhu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，lnc-mg 通過結(jié)合miR-125b調(diào)控骨骼肌發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子-IGF2的蛋白質(zhì)水平，進而調(diào)節(jié)肌肉的生長發(fā)育。近年來，在畜禽領(lǐng)域逐漸開展了lncRNA的相關(guān)研究。Ren等[7]在豬的胎兒滋養(yǎng)層鑒定出一種新的lncRNA，發(fā)現(xiàn)其在豬胎兒骨骼肌中表達上調(diào)，并顯著影響豬胎兒骨骼肌的發(fā)育。Li等[8]通過RNA-seq技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，在雞基因組中鑒定出281種與雞骨骼肌發(fā)育相關(guān)的新lncRNA。

綿羊肌肉發(fā)育相關(guān)的lncRNA研究正處于起步階段，劉瑞鑿等[9]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對烏珠穆沁羊和特克賽爾羊腓腸肌進行l(wèi)ncRNA測序，發(fā)現(xiàn)lncRNA TCONS_00102859只在特克賽爾羊腓腸肌中表達，并且隨著發(fā)育其表達量逐漸增高。進一步研究顯示，TCONS_00102859的過表達會引起肌肉分化相關(guān)基因MyoD和MyoG表達上調(diào)，MSTN表達下調(diào)，證明TCONS_00102859可能在成肌細胞的增殖分化中發(fā)揮作用。吳明明[10]通過對胚胎期綿羊90 d和120 d背最長肌樣本進行高通量測序，共鑒定出1 114個lncRNA，其中有466個差異表達lncRNA，并進一步證明，差異表達lnc-SEMT在肌肉發(fā)育中起正調(diào)控作用。Li等[11]對新疆地方品種-哈薩克羊進行了系統(tǒng)的分析，在哈薩克羊出生前后骨骼肌的比較中鑒定了1 566個lncRNA，其中差異表達的lncRNA為404個。蘇尼特羊，也叫戈壁羊，主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟蘇尼特左旗和右旗，是經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育而形成的地方良種。蘇尼特羊肉肌肉飽滿，瘦肉率高，蛋白質(zhì)含量高、脂肪低，膻味輕，深受國內(nèi)外用戶的好評。蘇尼特羊肌肉發(fā)育相關(guān)lncRNA的研究尚未有相關(guān)報道，因此，本研究以蘇尼特羊肌肉為研究對象，對120 d胎兒和5月齡羔羊背最長肌進行RNA-seq測序分析，以期為解析蘇尼特羊肌肉發(fā)育的分子機制提供理論基礎(chǔ)，同時為分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及RNA提取

試驗樣本所用群體來自內(nèi)蒙古蘇尼特右旗某蘇尼特羊原種場。對妊娠120 d蘇尼特羊和5月齡蘇尼特羊羔羊靜脈注射40 mg/kg BW的戊巴比妥鈉麻醉，屠宰，采集120 d蘇尼特羊胎兒背最長肌樣本3個、5月齡羔羊背最長肌樣本2個，樣品采集后立即置于液氮中，然后儲存于實驗室-80 ℃冰箱中。利用Trizol法分別提取胎兒120 d和5月齡羔羊背最長肌的總RNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop 2 000檢測RNA的純度及濃度。

1.2 文庫構(gòu)建、測序及轉(zhuǎn)錄本的拼裝

按照測序要求進行l(wèi)ncRNA文庫構(gòu)建，由于采集樣本的日期不同，首先對3個120 d 胎兒背最長肌RNA樣本進行等量混池測序(MFH_MLcn)，然后對 5月齡羔羊背最長肌進行并行測序(S5BZ_MS)。測序平臺為Illumina HiseqTM2500。利用fastx_toolkit(V0.0.13)軟件對測序得到的Raw reads進行質(zhì)控過濾。使用Tophat 2(V2.0.9)將過濾后的測序序列比對到綿羊參考基因組，應(yīng)用cufflinks軟件對比對后的bam文件進行轉(zhuǎn)錄本的拼接。

1.3 差異表達lncRNA的篩選和靶基因預(yù)測

首先通過5步篩選法進行基本的篩選：轉(zhuǎn)錄本exon個數(shù)篩選、轉(zhuǎn)錄本長度篩選、轉(zhuǎn)錄本已知注釋篩選、轉(zhuǎn)錄本表達量篩選和編碼潛能篩選，然后利用CPC、CNCI和pfam蛋白結(jié)構(gòu)域及PhyloCSF分析方法進行編碼潛能的分析，最后取交集鑒定新的候選lncRNA。從候選lncRNA中篩選出差異表達的lncRNA，差異表達分析使用Cuffdiff軟件，差異表達分析標(biāo)準(zhǔn)為∣log2(Fold change)∣≥1且q<0.05。使用Cuffdiff(http:∥cufflinks.cbcb.umd.edu/manual.html#cuffdiff)軟件對篩選所得到的lncRNA進行定量分析，從而得到各樣品中l(wèi)ncRNA的FPKM信息，對差異表達lncRNA的cis作用靶基因設(shè)定為lncRNA的上下游100 kb鄰近基因。

1.4 GO富集和KEGG通路分析

利用GOseq軟件[12]對預(yù)測的靶基因進行GO分析。使用KOBAS軟件[13]進行KEGG 通路分析。

1.5 lncRNA的熒光定量PCR驗證

隨機選取8個lncRNA，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。內(nèi)參基因選擇β-actin，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息如表1所示。熒光定量PCR反應(yīng)總體系20 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，TB Green Premix Taq Ⅱ 10 μL，Rox reference dye Ⅱ 0.4 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)，3個重復(fù)。用2-ΔΔCt法計算羔羊lncRNA的相對表達量，并與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行比對驗證。

表1 lncRNA引物序列信息Table 1 lncRNA primer sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)分析與質(zhì)控

對測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進行過濾分析，如表2所示，2組樣本的總Clean reads 的大小分別為17.94 G和 25.27 G。Q20和Q30的比列均在95%以上，表明測序質(zhì)量可靠。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況Table 2 Statement of data output quality

2.2 序列比對與拼接

質(zhì)控后的Clean reads比對到綿羊參考基因組結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，120 d胎兒組(MFH_MLcn) 樣本中Clean reads的86.42%能定位到基因組上的測序序列，4.67%在參考序列上有多個比對位置,reads在參考序列上唯一比對率為81.75%；羔羊組(S5BZ_MS)樣本中的Clean reads比對到基因組上的比例均為80%以上，比對到參考序列上多個比對位置的比例為5.3%～5.64%, reads在參考序列上唯一比對率為75.06%～77.17%。

表3 Reads 與參考基因組比對Table 3 Summary of the alignment of reads with the reference genome

2.3 lncRNA轉(zhuǎn)錄本的鑒定

利用cufflinks對轉(zhuǎn)錄片段進行拼接，初步篩選出10 3307個轉(zhuǎn)錄本。然后對這些轉(zhuǎn)錄本進行分步篩選，最終鑒定到1 112個候選lncRNA轉(zhuǎn)錄本，其中包括586個已知lncRNA和526個新lncRNA，詳細結(jié)果見圖1(a)。進一步對候選lncRNA進行分類，如圖1(b)所示，基因間型lncRNA占90.3%，反義型lncRNA 占9.7%。未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子型的lncRNA。

圖1 候選lncRNA 篩選與類型分布Fig.1 Screening and type distribution of candidate lncRNA

2.4 lncRNA結(jié)構(gòu)與特征分析

為研究蘇尼特羊肌肉中 lncRNA 的基本特征，對比分析了 lncRNA 與 mRNA的轉(zhuǎn)錄本長度、外顯子數(shù)、ORF長度及轉(zhuǎn)錄本表達水平。結(jié)果顯示，與mRNA相比，lncRNA長度區(qū)間在200～3 000 bp的lncRNA數(shù)為890個，占總數(shù)lncRNA的80.0%。每個lncRNA平均長度為2 517 bp，平均2.5個外顯子數(shù)(圖2(a))。包含2個和3個外顯子的lncRNA數(shù)占所有l(wèi)ncRNA的87.3%(971個)(圖2(b))。對lncRNA的開放讀碼框(ORF)進行分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)lncRNA的長度在500 bp以內(nèi)，平均數(shù)為123 bp。如圖2(c)所示，mRNA的ORF長度明顯大于lncRNA。這一結(jié)果也提示lncRNA在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等表觀調(diào)控方面起著重要的作用。對測序獲得的 lncRNA與 mRNA 的表達量進行比較，發(fā)現(xiàn)mRNA的整體表達量明顯高于lncRNA(圖2(d))。

(a) lncRNA與mRNA的轉(zhuǎn)錄本長度；(b) lncRNA與mRNA外顯子數(shù)目；(c) lncRNA與mRNA ORF長度；(d) lncRNA與mRNA轉(zhuǎn)錄本表達量；縱坐標(biāo)中的密度表示對應(yīng)橫坐標(biāo)軸數(shù)值的因子數(shù)/檢測因子的總數(shù)；FPKM表示每百萬測序堿基中每千個轉(zhuǎn)錄子測序堿基中所包含的測序片段數(shù)。(a) lncRNA and mRNA transcripts length; (b) lncRNA and mRNA exon number; (c) lncRNA and mRNA ORF length; (d) lncRNA and mRNA transcript expression level; Density in Y-axis represent the number of factors corresponding to the value of the abscissa axis/the total number of detection factors； FPKM represent number of sequenced fragments contained in every thousand transcripts of sequenced bases per million of sequenced bases.圖2 lncRNA與mRNA的結(jié)構(gòu)特征比較分析Fig.2 Comparative analysis of structural characteristics between lncRNA and mRNA

2.5 lncRNA的差異表達分析

在|log2(Fold change)|>1和q<0.05條件下，2組樣本之間的差異表達結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，在胎兒120 d組和 5月齡羔羊組中獲得399個差異表達的 lncRNA，其中212個表達上調(diào)，187個表達下調(diào)。

圖3 差異表達 lncRNA 火山圖Fig.3 Volcano map of differentially expressed IncRNA

對差異表達的lncRNA進行層次聚類分析來判斷差異轉(zhuǎn)錄本在不同實驗條件下的表達模式，由圖4(a)可知，羔羊組樣本間聚類在一起，與胎兒組差異明顯。此外，胎兒組上調(diào)基因?qū)?yīng)下調(diào)基因，而羔羊組與胎兒組基因表達模式有不同，羔羊組lncRNA的表達模式下調(diào)基因多于上調(diào)基因。之后，兩兩之間的差異表達組之間進行了韋恩圖(Venn)分析，結(jié)果如圖4(b)所示，共有11個lncRNA在所有差異表達組中被檢測到。差異表達lncRNA在不同樣本中的表達量見圖5,值得注意的是ENSOART00000028118、ENSOART00000028271、LNC_000424和LNC_000978轉(zhuǎn)錄本在2個組中都有較高表達。此外，LNC_000422在胎兒120 d中有表達，在5月齡羔羊中無表達；LNC_000942在5月齡羔羊中有表達，在胎兒120 d中無表達。ENSOART00000028384和LNC_000421在胎兒120 d中的表達量更高；LNC_000311和LNC_000719在5月齡羔羊中的表達量更高。

圖4 差異表達lncRNA分析Fig.4 Differential expression analysis of lncRNA

2.6 lncRNA 的熒光定量PCR驗證

為進一步驗證測序結(jié)果，并檢測其在綿羊肌肉中的表達，隨機選擇8個差異表達的lncRNA，其中LNC_000074, LNC_000196, LNC_000588在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為上調(diào)，LNC_000233, LNC_000276,LNC_000408, LNC_000586和 LNC_000649在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為下調(diào)，并通過qRT-PCR檢測其在胎兒及羔羊肌肉中的表達。由圖6可知，經(jīng) qRT-PCR 驗證，LNC_000074,LNC_000196和LNC_000588均上調(diào)表達，與RNA-seq測序結(jié)果上調(diào)一致；LNC_000223，LNC_000276，LNC_000408，LNC_000586和LNC_000649均下調(diào)表達，與RNA-seq測序結(jié)果下調(diào)一致。證明實時熒光定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表達趨勢一致。

圖5 差異表達lncRNA在不同樣本中的表達量Fig.5 Expression of differentially expressed lncRNA in different samples

圖6 差異表達lnRNA qRT-PCR與RNA-seq比較分析Fig.6 Comparison analysis of differentially expressed lncRNA by qRT-PCR and RNA-seq

2.7 差異表達lncRNA靶向mRNA預(yù)測

利用lncRNA和mRNA的定位來預(yù)測lncRNA在順式調(diào)控關(guān)系中的潛在目標(biāo)。將共同位置的閾值設(shè)置為lncRNA的上下游100KB，結(jié)果表明，626個差異表達lncRNA中503個lncRNA存在鄰近基因。對應(yīng)于1 273個靶基因。其中多個lncRNA具有共同的靶基因，如LNC_000421和LNC_000422的靶基因為RTL1等。也有l(wèi)ncRNA具有多個可變剪切靶向多個編碼基因，如編碼基因TNNT1，PPP1R12C,EPS8L1是LNC_000311的潛在目標(biāo)等，并且這些lncRNA呈現(xiàn)不同方向的調(diào)控作用。

2.8 靶基因的功能注釋分析(GO和KEGG)

對這些鄰近基因進行功能注釋分析，GO結(jié)果分別從生物學(xué)過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3個條目進行分類。結(jié)果如圖7顯示，MFH_MLcn vs S5BZ_MS差異表達lncRNA的靶基因顯著富集到了60個GO term條目中，其中，涉及代謝過程的調(diào)控，生物合成BP，蛋白結(jié)合GC以及免疫反應(yīng)MF等相關(guān)。另外，在其他GO term條目中也發(fā)現(xiàn)了包括肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育、骨骼肌細胞分化，骨骼肌收縮、橫紋肌細絲，肌肉組織發(fā)育等與骨骼肌發(fā)育緊密相關(guān)的GO term，提示這些lncRNA在肌肉發(fā)育的不同階段起著重要的調(diào)控作用。

圖7 差異lncRNA 的GO富集分析Fig.7 GO enrichment analysis of differential lncRNA

對這些靶基因基因進行KEGG通路分析，結(jié)果如圖8所示，這些靶基因主要涉及Wnt信號傳導(dǎo)途徑、Notch信號通路、Gap連接和甲狀腺激素合成等，都可能與骨骼肌的生長，發(fā)育和功能有關(guān)。這些結(jié)果表明lncRNA可能在骨骼肌的發(fā)育和生長中起重要作用，可根據(jù)以上功能注釋信息對這些lncRNA開展肌肉發(fā)育相關(guān)的研究提供了重要的信息。

圖8 差異表達lncRNA靶基因KEGG分析Fig.8 KEGG analysis of differentially expressed lncRNA target gene

3 討 論

近年來，隨著綿羊基因組研究的不斷深入，對其基因組進行了大量的注釋和功能分析，但對內(nèi)蒙古地方品種—蘇尼特羊長鏈非編碼RNA的研究鮮有報道。因此，本研究以蘇尼特羊肌肉為研究對象，對120 d胎兒和5月齡羔羊背最長肌進行RNA-seq測序分析，以期為解析蘇尼特羊肌肉發(fā)育的分子機制提供理論基礎(chǔ)，同時為分子輔助育種提供參考。

在本研究中，通過對蘇尼特羊胎兒120 d和5月齡蘇尼特羊背最長肌組織中的lncRNA進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，進一步預(yù)測lncRNA的靶基因以揭示他們的功能。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，對比分析了 lncRNA 與 mRNA 的長度、外顯子數(shù)、外顯子大小及表達水平，發(fā)現(xiàn)與mRNA相比，lncRNA長度區(qū)間在200～3 000 bp的lncRNA數(shù)占總數(shù)lncRNA的80.0%，說明lncRNA保守性較差。包含2個和3個外顯子的lncRNA數(shù)占所有l(wèi)ncRNA的87.3%，平均為2.5個外顯子數(shù)，外顯子數(shù)量比較少，與Cabili等[14]的研究結(jié)果一致。mRNA的ORF長度明顯大于lncRNA，說明蛋白質(zhì)編碼基因具有更長的ORF。對測序獲得的 lncRNA與 mRNA 的表達量進行比較，發(fā)現(xiàn)mRNA的整體表達量明顯高于lncRNA，可能與lncRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的能力有關(guān)。Li等[11]通過對綿羊的lncRNA和mRNA進行特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與mRNA相比，lncRNA的外顯子數(shù)量集中分布在2個或3個，且ORF長度較短，表達水平較低。本研究與Li等的研究結(jié)果一致，這些相似之處說明本研究中分析的lncRNA可靠性較高。在本研究中總共鑒定了 1 112 個候選lncRNA，包括586個已知lncRNA和526個新lncRNA，得到靶向mRNA編碼基因為1 273個，這些基因也為今后的研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

進一步對對胎兒120 d組(MFH_MLcn)和 5月齡羔羊組(S5BZ_MS)進行差異表達分析，共獲得399個差異表達的 lncRNA，其中212個表達上調(diào)，187個表達下調(diào)，說明不同發(fā)育時期蘇尼特羊肌肉的生長發(fā)育具有不同的lncRNA調(diào)控機制。Zhan等[15]通過構(gòu)建山羊胎兒(45、60和105 d妊娠)和出生后(出生后3 d)背最長肌的RNA文庫，在不同發(fā)育階段骨骼肌庫之間的配對比較中，共發(fā)現(xiàn)577個差異表達轉(zhuǎn)錄本。蘇尼特羊lncRNA和山羊lncRNA之間的差異可能歸結(jié)于品種和階段特異性。通過對lncRNA在不同樣本中的FPKM值進行比較，結(jié)果說明ENSOART00000028118、ENSOART00000028271、LNC_000424和LNC_000978均在胎兒120 d和5月齡羔羊中有表達，ENSOART00000028271、LNC_000978、LNC_000311和LNC_000719在5月齡羔羊中的表達量較高，ENSOART00000028118和LNC_000424則與之相反。其中，ENSOART00000028118和LNC_000424在5月齡羔羊組中的表達量顯著上調(diào)，該結(jié)果進一步證明ENSOART00000028118和LNC_000424在不同發(fā)育時期的蘇尼特羊肌肉組織中具有不同的調(diào)控作用，調(diào)控機制可能為:在胎兒120 d肌肉組織發(fā)育中起負調(diào)控作用，在5月齡羔羊肌肉組織發(fā)育中起正調(diào)控作用。ENSOART00000028271、LNC_000311和LNC_000719在5月齡羔羊肌肉組織中的表達量顯著下調(diào)，可能說明其在胎兒120 d肌肉組織發(fā)育中起正調(diào)控作用，在5月齡羔羊肌肉組織發(fā)育中起負調(diào)控作用。說明lncRNA的表達調(diào)控在不同時期有不同的表達方向，但仍需要進一步的實驗驗證。

文獻研究顯示，在本研究鑒定到顯著差異的lncRNA中， ENSOART00000028118、 ENSOART00000028384、ENSOART00000027214、ENSOART00000028894、LNC_000196、LNC_00023、LNC_000269、LNC_000307、LNC_000311、LNC_000421、LNC_000422、LNC_00459 和 LNC_000879分別靶向?qū)?yīng)與綿羊肌肉生長發(fā)育相關(guān)的基因PPP1R12C、EPS8L1、RTL1、SIRT1、TRIM7、KLHL40、TNNI1、MEF2C、FOSB、JPH2和MYH1。研究表明，RTL1基因被證實參與促進小鼠肌肉的增長[16]，并且可顯著調(diào)控綿羊的肌肉肥大[17]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1基因?qū)∪夂椭镜陌l(fā)育均具有調(diào)控作用[18]。TRIM7為糖原蛋白相互作用蛋白(GNIP),并被證明在骨骼肌中高表達[19]。Chao等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，KLHL40基因被預(yù)測為LOC105603392的一個順式調(diào)控基因，并且被證明為肌肉的特異轉(zhuǎn)錄基因位點[21]。而作為慢骨骼肌鈣蛋白基因，TNNT1、TNNI1和TNNC1在綿羊肌肉中具有一致的表達模式[22]，同時有研究證明他們是維持緩慢肌纖維的重要基因[23]。Potthoff等[24]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌中 MEF2C 的缺失會導(dǎo)致肌節(jié)組織出現(xiàn)異常。此外，F(xiàn)OSB作為FOS家族的一員，在細胞增殖、分化和骨骼發(fā)育中起著重要的作用。FOS家族編碼亮氨酸拉鏈蛋白，與JUN家族的蛋白質(zhì)二聚體結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1，參與細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化[25]。研究也表明JPH2基因被認(rèn)為是心肌細胞內(nèi)T-小管成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，其突變可導(dǎo)致擴張型心肌病[26]，由此可以證明JPH2具有調(diào)節(jié)骨骼肌中生物學(xué)功能的作用。此外發(fā)現(xiàn) 120 d 羔羊胎兒與5月齡羔羊中LNC_000421和LNC_000422與其靶基因RTL1之間呈正調(diào)控，說明LNC_000421和LNC_000422通過對靶基因RTL1的調(diào)控來促進肌肉生長。ENSOART00000028118與其靶基因IGF2之間呈正調(diào)控，LNC_000311與其對應(yīng)的靶基因TNNI3之間也呈現(xiàn)正調(diào)控趨勢，說明ENSOART00000028118和LNC_000311參與了蘇尼特羊胚胎期至性成熟期發(fā)育階段骨骼肌的發(fā)育過程。這些結(jié)果進一步揭示了lncRNA及其靶基因的協(xié)同關(guān)系,提示接下來可以側(cè)重研究這些lncRNA在蘇尼特羊肌肉中的功能及作用機制。

在對差異表達的lncRNA進行GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，在一些lncRNA在肌肉調(diào)節(jié)中起重要作用的通路中顯著富集。主要涉及Wnt信號通路[27]、Notch信號通路、Gap連接[28]和甲狀腺激素合成[29]等相關(guān)通路，均與肌肉發(fā)育相關(guān)，證明這些差異表達的lncRNA可以通過以上信號通路對肌肉的生長發(fā)育進行調(diào)控。Li等[11]通過對哈薩克羊進行KEGG分析發(fā)現(xiàn)主要涉及Wnt信號傳導(dǎo)途徑、鈣信號傳導(dǎo)途徑、Gap連接、河馬信號傳導(dǎo)和甲狀腺激素合成等信號通路，其可能與骨骼肌的生長，發(fā)育和功能有關(guān)。本研究結(jié)果與Li的部分相似，進一步提高了本研究預(yù)測關(guān)鍵基因及其相關(guān)通路的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究利用高通量測序技術(shù)對蘇尼特羊不同發(fā)育階段肌肉進行了初步的鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)在蘇尼特羊肌肉中存在大量的lncRNA，其表達水平在不同的發(fā)育階段存在著一定的差異。通過GO和KEGG富集分析，這些差異表達lncRNA涉及代謝過程的調(diào)控，生物合成，基因表達，蛋白結(jié)合以及mTOR信號通路、FoxO信號通路、胰島素信號、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)、Wnt信號通路、間隙連接等信號通路。并篩選出13個與不同發(fā)育階段骨骼肌相關(guān)的候選lncRNA和靶基因，為從lncRNA的角度更好地理解蘇尼特羊肌肉生長發(fā)育的遺傳調(diào)控機制提供了理論基礎(chǔ)，也為綿羊分子輔助育種提供參考。