欒歷歷,劉恩媛,顧 新,孫建新

北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 北京 100083

土壤酶活性能反應(yīng)土壤生物化學(xué)過(guò)程中微生物對(duì)C、N、P等養(yǎng)分元素的吸收利用。目前在生態(tài)學(xué)研究中,C獲取酶通常用β- 1,4-葡萄糖苷酶(β- 1,4-glucosidase,BG)表示,N獲取酶通常用 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)和亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)表示,P獲取酶通常用酸性(或堿性)磷酸酶(acid or alkaline phosphatase,AP)表示,并用酶活性的比值關(guān)系BG∶(NAG + LAP)∶AP 來(lái)評(píng)價(jià)微生物對(duì)C、N、P 養(yǎng)分需求狀況,即用生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量來(lái)揭示微生物生長(zhǎng)和代謝過(guò)程的土壤養(yǎng)分資源的有效性[1]。全球尺度上,C、N、P獲取酶活性比約為1∶1∶1的關(guān)系,反映了C、N、P循環(huán)的耦合關(guān)系[2],在小區(qū)域尺度上,土壤微生物的生長(zhǎng)受到養(yǎng)分限制時(shí),C、N、P獲取酶活性比偏離1∶1∶1的關(guān)系[3- 5]。盡管目前關(guān)于土壤胞外酶活性對(duì)土壤養(yǎng)分變異的響應(yīng)已經(jīng)取得很大進(jìn)展,但由于土壤養(yǎng)分狀況、土壤質(zhì)地、氣候條件等眾多因素的影響,不同區(qū)域土壤胞外酶活性對(duì)土壤養(yǎng)分變異的適應(yīng)機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議[6- 8]。在微生物研究中,通常將微生物對(duì)底物所能承受的限度定義為元素比率閾值(threshold elemental ratio,TER)。元素比率閾值是建立在代謝理論和化學(xué)計(jì)量理論的基礎(chǔ)上,整合了土壤微生物生物量、生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量以及微生物元素利用效率對(duì)底物C∶N∶P的適應(yīng)策略,如果底物C∶X(X為N或P)超過(guò)這個(gè)閾值,則微生物受養(yǎng)分X限制[9]。

土壤酶活性受凋落物質(zhì)量和數(shù)量的影響,有研究顯示隨著凋落物處理中針葉的比例降低,土壤過(guò)氧化氨酶、多酪氧化酶、脲酶的活性升高,提高幅度大于15%[10];也有研究發(fā)現(xiàn)脲酶、脫氨酶的活性在混合凋落物處理下要顯著高于單一凋落物處理,凋落物的多樣性増加不一定會(huì)提高微生物活性,凋落物的化學(xué)組成很重要[11];也有研究表明剔除凋落物處理下β- 1,4-葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性均顯著低于葉調(diào)落物加倍處理及混合凋落物加倍處理[12]。全球氣候變化引起的氮沉降通過(guò)改變森林生態(tài)系統(tǒng)土壤理化性質(zhì)而改變微生物的功能狀況,進(jìn)而影響土壤酶活性[12]。有研究表明氮添加會(huì)降低土壤中纖維素酶活性,增加脲酶和蔗糖酶活性[13];也有研究發(fā)現(xiàn)氮添加對(duì)β- 1,4-葡萄糖苷酶活性的影響隨著氮添加濃度增加由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制[14]。但目前凋落物輸入和氮添加同時(shí)改變是否會(huì)通過(guò)影響土壤酶活性而影響土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量還不清楚。

因此,本研究基于課題組早先的松櫟混交林實(shí)驗(yàn)樣地,通過(guò)不同凋落物處理和氮濃度添加,測(cè)定了土壤理化性質(zhì)、微生物生物量和胞外酶活性,以期探究以下問(wèn)題：(1)不同凋落物處理和氮添加土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量是否差異顯著以及是否偏離1∶1∶1的關(guān)系？(2)不同凋落物處理和氮添加土壤微生物對(duì)C、N、P的利用效率和元素比率閾值是否差異顯著？(3)不同凋落物處理和氮添加下土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量主要受生物因子還是非生物因子的影響？以期為土壤微生物對(duì)全球變化的響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地設(shè)在山西太岳山生態(tài)定位站靈空山自然保護(hù)區(qū)(36°38.736′N,12°06.967′E),平均海拔為1618m,該保護(hù)區(qū)屬典型的暖溫帶半干旱大陸性季風(fēng)氣候,年平均氣溫8.6℃,年均降水量為662mm,年均日照時(shí)數(shù)為2650h,土壤類型主要是褐土和棕壤。該保護(hù)區(qū)內(nèi)主要優(yōu)勢(shì)樹種為：油松(Pinustabuliformis)、遼東櫟(Quercuswutaishanica)、華北落葉松(Larixprincipisrupprechtii)、山楊(Populusdavidiana)和白樺(Betulaplatyphylla),主要山地灌叢為：黃刺玫(Rosaxanthina)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、胡枝子(Lespedezabicolor)等。本研究選取的是該地區(qū)典型的油松-遼東櫟混交林[13]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)樣地于2010年9月布設(shè)在靈空山林場(chǎng)油松-遼東櫟針闊混交林,樣地中油松、遼東櫟的數(shù)量比為1∶2,油松的平均胸徑為19.6cm,平均樹高分別為7.3cm,遼東櫟的平均胸徑為18.6cm,平均樹高為9.5cm。在該松櫟混交林內(nèi)建立凋落物和氮添加雙因子交互處理實(shí)驗(yàn)樣地,實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),布設(shè)了60個(gè)2 m×2 m的小樣方,小樣方之間間距0.5m,分為15列,每列4個(gè),每3列劃分為1個(gè)區(qū)組,區(qū)組之間相隔1 m,區(qū)組重復(fù)數(shù)為5。每個(gè)區(qū)組內(nèi),分別設(shè)置4種凋落物和3個(gè)梯度的氮添加的交互處理。凋落物處理：在每一列中隨機(jī)將一個(gè)樣方中的所有凋落物移至另一樣方中,形成剔除凋落物(N)和混合凋落物加倍(LB);剩余兩個(gè)小樣方進(jìn)行凋落物葉和枝果組分互換,形成葉凋落物加倍處理(L)和枝果凋落物加倍處理(B)。太岳山地區(qū)氮沉降量約為21.2 kgN hm-2a-1,參照當(dāng)?shù)乇尘爸岛捅泵繦arvard forest 等的研究方法模擬氮沉降的強(qiáng)度和頻度,氮添加處理設(shè)為3個(gè)梯度：0 gN m-2a-1(N0),5 gN m-2a-1(N5),10 gN m-2a-1(N10),氮添加施加的氮肥為尿素,每列的施氮率相等,每個(gè)區(qū)組內(nèi)各列施氮率完全隨機(jī)(圖1)。從2010年到2018年,每年進(jìn)行凋落物處理和氮添加,每次取樣后按照樣地設(shè)計(jì)對(duì)新輸入的凋落物進(jìn)行整理(平均3個(gè)月一次)和施加氮肥,施氮方法：將氮肥和少量土壤混合后均勻撒于小樣方中[14]。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Diagram of experimental design實(shí)驗(yàn)樣地于2010年9月布設(shè),60個(gè)小樣方(2 m×2 m);B：枝果凋落物加倍Fine woody litter double;L：葉凋落物加倍Leaf litter double;LB：混合凋落物加倍Mixed litter double;N∶剔除凋落物litter removal;N0：0 gN m-2 a-1;N5：5 gN m-2 a-1;N10：10gN m-2 a-1

1.3 土壤樣品采集和測(cè)定

分別于2018年6月、8月、10月,在每個(gè)小樣方內(nèi)用3cm 內(nèi)徑的土鉆“S”型選取5個(gè)點(diǎn),采集表層土壤0—5cm,并剔除土樣中的石礫、根系等雜物,迅速放入低溫冷藏箱,過(guò)2mm篩后,其中一部分于-20 ℃冰箱內(nèi)保存用于測(cè)定土壤微生物和酶活性指標(biāo),另一部分自然風(fēng)干,用于分析土壤理化性質(zhì)。

土壤含水量(SWC)采用鮮土在105 ℃下烘干至恒重(48 h 以上)計(jì)算得出;pH用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定(土∶水=1∶2.5);土壤有機(jī)碳(SOC)的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化法;土壤全氮(TN)的測(cè)定采用凱式定氮法;土壤全磷(TP)的測(cè)定采用鉬銻抗比色法;土壤可溶性碳(DOC)、可溶性總氮(TSN)采用K2SO4浸提法測(cè)定;土壤有效磷(SAP)的測(cè)定采用NaHCO3浸提—銻抗比色法;土壤微生物生物量碳氮磷(MBC、MBN、MBP)的測(cè)定采用氯仿熏蒸—浸提法。以上指標(biāo)測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析方法》[15]。

土壤胞外酶β- 1,4-葡萄糖苷酶(BG)、β- 1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、磷酸酶(AP)均采用底物誘導(dǎo)法測(cè)定[16- 17]。BG和NAG的測(cè)定：稱取1g過(guò)篩2mm的鮮土,放入50mL酶試管內(nèi),加0.25 mL甲苯,4mL 0.05mol/L緩沖液和1mL底物,在黑暗且密閉培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結(jié)束后立即放置在冰浴條件下,加1mL 0.5mol/L CaCl2和4mL 0.1mol/L Tris(三羥基氨基甲烷)緩沖溶液(pH調(diào)至12),充分混合后用定量濾紙過(guò)濾,將濾液用紫外分光光度計(jì)在405nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色測(cè)定,每個(gè)土壤樣品均作對(duì)照。LAP和AP的測(cè)定：與BG和NAG的測(cè)定不同之處,培養(yǎng)結(jié)束后用0.5mol/L NaOH溶液代替上述的0.1mol/L Tris緩沖溶液。BG測(cè)定的底物為0.05mol/L的β- 1,4葡萄糖溶液,NAG測(cè)定的底物為0.01mol/L的β- 1,4-N-乙酰葡萄糖溶液,LAP測(cè)定的底物為0.01mol/L的L-亮氨酸- 4-硝基苯胺溶液,AP測(cè)定的底物為0.05mol/L的對(duì)硝基酚溶液,四種酶活性的單位均用nmol·g-1·h-1表示。

1.4 土壤樣品數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

(1)土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的計(jì)算公式[4]

EEAC∶N=BG/(NAG+ LAP)

(1)

EEAC∶P=BG/AP

(2)

EEAN∶P=(NAG+ LAP)/AP

(3)

式中EEA為土壤胞外酶活性,BG為β- 1,4-葡萄糖苷酶,NAG為β-N-乙酰葡糖氨糖苷酶,LAP為亮氨酸氨基肽酶,AP為酸性磷酸酶。

(2)土壤微生物養(yǎng)分利用效率的計(jì)算公式[18]

CUEC∶X=CUEmax(SC∶X/(SC∶X+KX))

(4)

其中SC∶X=(1 /EEAC∶X)(BC∶X/LC∶X)

XUEX∶C=XUEmax(SX∶C/(SX∶C+ Kc))

(5)

其中SX∶C=(1-EEAX∶C)(BX∶C/LC)

式中X為N或P,KX、KC為半飽和常數(shù),KX=0.5,KC=0.5;CUEmax是C能提供微生物生長(zhǎng)能量的上限,CUEmax=0.6;XUEmax是N、P能提供微生物生長(zhǎng)能量的上限,XUEmax=1.0;BC∶X為微生物生物量C∶N或微生物生物量C∶P;LC∶X為土壤C∶N或者土壤C∶P。SC:X為土壤微生物生物量C∶N或C∶P、胞外酶活性比C∶N或C∶P和土壤C∶N或土壤C∶P的比值，SX∶C為土壤微生物生物量N∶C或P∶C、胞外酶活性比N∶C或P∶C和土壤N∶C或土壤P∶C的比值。

(3)元素比例閾值的計(jì)算公式[18]

TERC∶X= (AXBC∶X)/ CUEC∶ X

(6)

其中AX=CUEC∶X/ SC∶X

式中X為N或P,AX為N、P的同化效率。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用 SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用重復(fù)測(cè)量方差分析(Repeated measures analysis of variance,RMANOVA)上述各個(gè)指標(biāo)在不同取樣時(shí)間與凋落物及氮添加之間有無(wú)交互作用;用單變量多因素方差分析(Univariate)上述各個(gè)指標(biāo)對(duì)凋落物和氮添加及其交互作用的響應(yīng);同時(shí),用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析上述各個(gè)指標(biāo)在4種凋落物處理和3種氮濃度添加中的差異,采用最小顯著差異(LSD)進(jìn)行多重比較(P<0.05);用冗余分析(RDA)土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量與土壤生物與和非生物因子之間的解釋率;用 SigmaPlot 12.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凋落物處理和氮添加土壤理化性質(zhì)、微生物生物量及土壤酶活性

通過(guò)重復(fù)測(cè)量方差分析表明不同取樣時(shí)間(2018年6月、8月和10月)與凋落物及氮添加之間無(wú)交互作用,通過(guò)單變量多因素方差分析表明上述測(cè)定指標(biāo)凋落物處理和氮添加之間無(wú)交互作用。SWC、SOC、TN、DOC、TSN、SAP、MBC、MBN在不同凋落物處理下差異顯著,不同氮濃度添加下無(wú)顯著差異。在不同凋落物處理下,均表現(xiàn)為在葉凋落物加倍和混合凋落物加倍的處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理;TSN在不同氮濃度添加顯著差異,表現(xiàn)為N0、N5處理高于N10處理;pH、TP、MBP在凋落物處理和氮添加下均無(wú)顯著差異(表1)。BG、NAG、LAP、AP在不同凋落物處理下差異顯著,不同氮濃度添加下無(wú)顯著差異。在不同凋落物處理下,BG、NAG、AP表現(xiàn)為L(zhǎng)、LB>B、N,LAP表現(xiàn)為L(zhǎng)、LB

表1 不同凋落物和氮添加處理下土壤理化性質(zhì)和微生物生物量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

圖2 不同凋落物和氮添加處理下土壤胞外酶活性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.2 Soil microbial biomass and extracellular enzyme among treatments of litter and nitrogen (Mean±SE)圖中不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05)

2.2 不同凋落物處理和氮添加土壤微生物與生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量特征

不同凋落物處理和氮添加下,土壤微生物生物量碳氮比(MBC∶MBN)、微生物生物量碳磷比(MBC∶MBP)、微生物生物量氮磷比(MBN∶MBP)均無(wú)顯著差異(圖3)。

土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比用lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP 表示,在不同凋落物處理下,lnBG∶ln(NAG+ LAP)、lnBG∶lnAP和ln(NAG+ LAP)∶lnAP均差異顯著,表現(xiàn)為葉凋落物加倍和混合凋落物加倍的處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理;不同氮濃度添加下,土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量均無(wú)顯著差異(圖4)。B處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.96∶1;L處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為1.02∶0.99∶1;LB處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.99∶1;N處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.95∶1;N0處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97∶0.96∶1;N5處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1;N10處理∶lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1。整體上,溫帶松櫟混交林樣地lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.98∶0.97∶1,其中, lnBG∶ln(NAG+ LAP)為1.01, lnBG∶lnAP為0.98,ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97。

圖3 不同凋落物和氮添加處理下土壤微生物化學(xué)計(jì)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.3 Stoichiometric of soil microbial biomass among treatments of litter and nitrogen(mean ± SE)圖中不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05);MBC∶MBN∶微生物生物量碳氮比soil microbial biomass C∶N;MBC∶MBP：微生物生物量碳磷比soil microbial biomass C∶P;MBN∶MBP：微生物生物量氮磷比soil microbial biomass N∶P

圖4 不同凋落物和氮添加處理下土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.4 Soil ecoenzymatic stoichiometry among treatments of litter and nitrogen(Mean ± SE)不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05); lnBG∶ln(NAG+ LAP)表示碳氮獲取酶活性比; lnBG∶lnAP表示碳磷獲取酶活性比; ln(NAG+ LAP)∶lnAP表示氮磷獲取酶活性比

2.3 不同凋落物處理和氮添加土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值

土壤微生物碳利用效率(CUEC∶N和CUEC∶P)在不同凋落物處理下差異顯著,表現(xiàn)為枝果凋落物加倍和剔除凋落物的樣地高于葉凋落物加倍和混合凋落物加倍的樣地,不同氮濃度添加下無(wú)顯著差異;土壤微生物氮利用效率(NUEN∶C)和微生物磷利用效率(PUEP∶C);不同凋落物處理和氮濃度添加下均無(wú)顯著差異(表2)。土壤微生物碳氮比率閾值(TERC∶N)在不同凋落物和氮添加處理下均無(wú)顯著差異;土壤微生物碳磷比率閾值(TERC∶P)在不同凋落物處理下表現(xiàn)為L(zhǎng)、LB > B、N,不同氮濃度添加下差異不顯著(圖5)。土壤CUEC∶N和CUEC∶P分別與TERC∶N和TERC∶P顯著正相關(guān)(圖6);土壤NUEN∶C與TERC∶N顯著負(fù)相關(guān)(圖6);土壤PUEP∶C與TERC∶P顯著負(fù)相關(guān)(圖6)。

表2 不同凋落物和氮添加處理下土壤微生物養(yǎng)分利用效率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

圖5 不同凋落物和氮添加處理下元素比率閾值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.5 Threshold elemental ratio (TERC∶N and TERC∶P) of soil microbial community among treatments of litter and nitrogen (Mean ± SE)不同小寫字母表示相同施氮量不同凋落物處理間的差異顯著;不同大寫字母表示相同凋落物處理不同氮濃度添加的差異顯著(P<0.05);CUE ：微生物碳利用效率Microbial carbon use efficiency;NUE：微生物氮利用效率Microbial nitrogen use efficiency;PUE：微生物磷利用效率Microbial phosphorus use efficiency

圖6 土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比例閾值Fig.6 Soil microbial nutrient utilization efficiency and threshold element ratios (TER)CUE：微生物碳利用效率microbial carbon use efficiency;NUE：微生物氮利用效率microbial nitrogen use efficiency;PUE：微生物磷利用效率microbial phosphorus use efficiency;

2.4 影響土壤胞外酶活性與生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的主要因子

相關(guān)性分析表明,BG和NAG與pH顯著負(fù)相關(guān),與SWC、SOC、TN、DOC、STN、SAP、MBC、MBN顯著正相關(guān);LAP與pH顯著正相關(guān),與SWC、SOC、TN、DOC、STN、MBC、MBN顯著負(fù)相關(guān);AP與TP、SAP顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05,圖7)。EEAC∶N與SWC顯著正相關(guān),與土壤C∶N無(wú)顯著相關(guān)性;EEAC∶P與pH顯著負(fù)相關(guān),與土壤C∶P顯著正相關(guān);EEAN∶P與pH呈顯著負(fù)相關(guān),與土壤N∶P顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05,圖7)。RDA分析表明,土壤理化性質(zhì)和微生物生物量共解釋胞外酶活性26.4%的變異,其中土壤pH、TN、SOC是土壤酶活性的顯著影響因子,分別解釋了土壤胞外酶活性14.3%,7.3%,2.2%的變異,土壤pH是土壤酶活性的最大解釋因子(表3)。土壤生物和非生物因子共解釋土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量30.7%的變異,其中土壤pH、C∶P、N∶P是土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的顯著影響因子,分別解釋了土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量13.1%,5.8%,4.8%的變異,土壤pH是土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的最大解釋因子(表4)。

圖7 土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis (RDA) of soil extracellular enzyme activity and ecoenzymatic stoichiometrySWC∶土壤含水率Soil water content;SOC∶土壤有機(jī)碳Soil organic carbon;TN∶土壤全氮Total nitrogen;TP：土壤全磷Total phosphorus;DOC∶可溶性碳 Soluble carbon;TSN∶土壤可溶性總氮Total soluble nitrogen;SAP：有效磷Available phosphorus;MBC∶微生物生物量碳Microbial biomass carbon;MBN∶微生物生物量氮Microbial biomass nitrogen;MBP：微生物生物量磷Microbial biomass phosphorus;BG：β- 1,4-葡萄糖苷酶β- 1,4-glucosidase; NAG：β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase; LAP：亮氨酸氨基肽酶leucine aminopeptidase; AP：酸性磷酸酶acid phosphatase;EEA：碳氮酶活性比extracellular enzyme

3 討論

3.1 不同凋落物處理和氮添加對(duì)土壤理化性質(zhì)、微生物生物量及土壤酶活性的影響

通常情況下,林地的葉凋落物量大于枝果凋落物量[19],而葉凋落物C∶N、酸不溶殘留物∶氮(AUR∶N)的值顯著低于枝果凋落物,葉凋落物相對(duì)枝果凋落物分解較快,土壤中的微生物可利用養(yǎng)分相對(duì)較多[12]。本研究中,凋落物處理與氮添加無(wú)交互影響。在不同凋落物處理下,土壤SWC、SOC、TN、MBC、MBN差異顯著,均表現(xiàn)為在葉凋落物加倍(L)和混合凋落物加倍(LB)的處理高于枝果凋落物加倍(B)和剔除凋落物處理(N),不同氮濃度添加下無(wú)顯著差異,與之前本樣地研究結(jié)果一致[12,14];DOC、TSN、SAP表現(xiàn)為L(zhǎng)、LB>B、N,有研究指出,添加凋落物可以提高土壤DOC、TSN[20]和SAP的含量[21];本研究中土壤可溶性總氮(TSN)表現(xiàn)為N5處理顯著高于N10,土壤可溶性總氮包括可溶性有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮,本研究和早先課題組研究均發(fā)現(xiàn)本樣地土壤微生物生物量氮隨施氮濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì),早先課題組研究發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮隨施氮濃度的增加先增加后降低,這預(yù)示著長(zhǎng)期的過(guò)量氮添加可能會(huì)降低微生物生物量及其活性?？赡墚?dāng)?shù)砑拥揭欢ǔ潭葧r(shí),土壤微生物受到了其他因素的制約。土壤TP和MBP在凋落物處理及氮添加下均無(wú)顯著差異,有研究表明土壤磷主要來(lái)自巖石風(fēng)化,取決于土壤質(zhì)地[22],土壤MBP的調(diào)控機(jī)制相對(duì)復(fù)雜,微生物對(duì)P的攝取獨(dú)立于C和N的攝取[23]。

有研究指出凋落物輸入和N 添加會(huì)影響土壤胞外酶活性[12,24- 26]。本研究中,不同氮濃度添加下,土壤胞外酶活性均無(wú)顯著差異。不同凋落物處理下,BG、NAG、AP 表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的處理高于枝果凋落物輸入和剔除凋落物處理,而LAP表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的處理低于枝果凋落物輸入和剔除凋落物處理(圖2),可能是LAP與BG、NAG、AP負(fù)相關(guān)關(guān)系,LAP與BG、NAG、AP出現(xiàn)解耦現(xiàn)象,造成這種現(xiàn)象的原因可能是LAP和BG、NAG、AP酶活性檢測(cè)的基質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物不同[2,8]。

3.2 不同凋落物處理和氮添加對(duì)土壤微生物與生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的影響

不同凋落物處理和氮添加下,微生物化學(xué)計(jì)量均無(wú)顯著差異(圖3)。有研究指出,微生物生物量C∶N∶P的可塑性是由微生物群落結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致的[27- 28],但微生物的數(shù)量、群落組成以及代謝活動(dòng)的復(fù)雜性,使微生物生物量C∶N∶P對(duì)底物C∶N∶P的響應(yīng)仍不明確[29],研究普遍認(rèn)為由于微生物本身的內(nèi)穩(wěn)態(tài)使微生物生物量C∶N∶P變異性很小[30]。早先本課題組研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌：真菌受不同凋落物處理和氮添加影響并不顯著[14]。本研究中,MBC∶MBN、MBN∶MBP和MBC∶MBP的平均值分別為5.7、3.2和17.4,均低于全球土壤平均值[31],本實(shí)驗(yàn)樣地MBC∶MBN比值偏低,可能是葉凋落物加倍和混合凋落物加倍使土壤中有機(jī)碳含量相對(duì)增加,有利于細(xì)菌的生長(zhǎng),顯著提高了細(xì)菌總量以及革蘭氏陰性細(xì)菌的相對(duì)含量[14],MBN∶MBP的偏低可能是微生物生長(zhǎng)需要投資更多富含磷的核糖體RNA[32]。

表3 影響土壤胞外酶活性的主要因子

表4 影響土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的主要因子

土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量可以反映土壤養(yǎng)分資源的有效性和微生物對(duì)養(yǎng)分需求的變化[2]。在不同凋落物處理下,lnBG∶ln(NAG+ LAP)、lnBG∶lnAP和 ln(NAG+ LAP)∶lnAP均差異顯著,表現(xiàn)為在葉凋落物輸入的處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理,王冰冰等[33]研究發(fā)現(xiàn)岷江灌叢樣地 lnBG：ln(NAG+ LAP)顯著高于空地[8],說(shuō)明凋落物的質(zhì)和量會(huì)改變森林土壤的養(yǎng)分狀況,微生物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量來(lái)調(diào)控對(duì)自身生長(zhǎng)的養(yǎng)分利用。本研究中,不同氮濃度添加下,土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量均無(wú)顯著差異(圖4),Chen等研究發(fā)現(xiàn)氮添加改變了土壤胞外酶的活性,但并未改變土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量。可能森林土壤氮循環(huán)受很多因素的影響,氮添加對(duì)森林土壤微生物的作用機(jī)制并非一個(gè)瞬間或簡(jiǎn)單的過(guò)程。因此,土壤微生物對(duì)長(zhǎng)期氮添加的調(diào)控機(jī)制未來(lái)仍需繼續(xù)探討。本研究中,B處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.96∶1;L處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為1.02∶0.99∶1;LB處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.99∶1;N處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.96∶0.95∶1;N0處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97∶0.96∶1;N5處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1;N10處理：lnBG∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.99∶0.98∶1。說(shuō)明不同凋落物和氮添加處理下,土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量并未明顯偏離1∶1∶1的關(guān)系,說(shuō)明說(shuō)明微生物應(yīng)對(duì)外界變化具有較強(qiáng)的“內(nèi)穩(wěn)態(tài)”調(diào)節(jié)能力,土壤微生物在自身代謝過(guò)程中, 通過(guò)調(diào)控胞外酶來(lái)適應(yīng)生態(tài)系統(tǒng)中C、N、P的變化[29]。整體上,溫帶松櫟混交林樣地lnBG ∶ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.98∶0.97∶1,其中,lnBG∶ln(NAG+ LAP)為1.01,lnBG∶lnAP為0.98,ln(NAG+ LAP)∶lnAP為0.97。說(shuō)明本研究區(qū)內(nèi),土壤微生物對(duì)P獲取酶的投資相對(duì)高于C和N獲取酶的投資,土壤中微生物的生長(zhǎng)可能受到相對(duì)的P限制,大多數(shù)的研究認(rèn)為亞熱帶地區(qū)磷是生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的限制因子[6- 7,34- 35]。本研究中,不同凋落物處理,微生物化學(xué)計(jì)量無(wú)顯著差異,而土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量差異顯著,說(shuō)明在土壤養(yǎng)分條件發(fā)生改變下,土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量比微生物化學(xué)計(jì)量響應(yīng)更加敏感,可以更好的反映土壤養(yǎng)分資源的有效性和微生物對(duì)養(yǎng)分需求的變化。

3.3 土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值

土壤微生物養(yǎng)分利用效率指將底物轉(zhuǎn)化為自身生物量的效率,與陸地生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)直接相關(guān)[18,27]。不同凋落物處理下,土壤微生物碳利用效率(CUEC∶N和CUEC∶P)差異顯著,表現(xiàn)為枝果凋落物輸入和剔除凋落物的樣地高于有葉凋落物輸入的樣地,有研究指出,CUE與EEAC∶P呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[18],本研究中,EEAC∶P∶L、LB > B、N,CUEC∶P∶L、LB < B、N,說(shuō)明有葉凋落物輸入的樣地相對(duì)無(wú)葉凋落物輸入的樣地微生物可利用的碳源充足,微生物通過(guò)調(diào)節(jié)酶活性對(duì)養(yǎng)分變異做出反饋來(lái)調(diào)控土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。土壤微生物氮利用效率(NUEN∶C)和微生物磷利用效率(PUEP∶C)差異均不顯著,目前關(guān)于NUE和PUE的研究較少,有研究指出土壤微生物對(duì)于P的吸收是獨(dú)立于C、N的,C和N的攝取主要通過(guò)氨基酸和氨基糖,P的攝取主要通過(guò)細(xì)胞膜相關(guān)的載體蛋白進(jìn)行[36]。不同氮濃度添加下,CUEC∶N、CUEC∶P、NUEN∶C和PUEP∶C差異均不顯著,可能由于本實(shí)驗(yàn)的氮濃度添加相對(duì)較低或森林土壤氮循環(huán)的復(fù)雜性,土壤理化性質(zhì)、微生物生物量、胞外酶活性以及生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量均無(wú)顯著差異,從而對(duì)土壤微生物養(yǎng)分利用效率無(wú)顯著影響。

在微生物研究中,通常將微生物對(duì)底物所能承受的限度定義為元素比率閾值(TER)。元素比率閾值是建立在代謝理論和化學(xué)計(jì)量理論的基礎(chǔ)上,整合了土壤微生物生物量、生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量以及微生物元素利用效率對(duì)底物C∶N∶P的適應(yīng)策略,如果底物C∶X(X為N或P)超過(guò)這個(gè)閾值,則微生物受養(yǎng)分X限制[28- 29],低的TERC∶N和TERC∶P表明土壤微生物更易受N和P的限制[37-38]。本研究中,TERC∶N在不同凋落物和氮添加處理下均無(wú)顯著差異,說(shuō)明不同處理下土壤微生物對(duì)N的承受限度沒(méi)有差異;TERC∶P在不同凋落物處理下表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的樣地高于無(wú)葉凋落物輸入的樣地(圖5),說(shuō)明葉凋落物輸入相對(duì)提高了土壤微生物對(duì)P的承受限度,可相對(duì)緩解P的限制,土壤有效磷(SAP)表現(xiàn)為有葉凋落物輸入的樣地高于無(wú)葉凋落物輸入的樣地(表1)。

土壤微生物養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值的關(guān)系可為底物變化微生物的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)[39]。本研究中,土壤CUEC∶N和CUEC∶P分別與TERC∶N和TERC∶P顯著正相關(guān)(圖6),說(shuō)明土壤微生物在自身調(diào)節(jié)過(guò)程中,通過(guò)胞外酶與土壤中C、N、P的利用效率之間的耦合關(guān)系對(duì)土壤環(huán)境進(jìn)行正負(fù)效應(yīng)驅(qū)動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)氣候變化對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成的影響[18]。目前,關(guān)于土壤微生物氮和磷養(yǎng)分利用效率與元素比率閾值相關(guān)性的研究較少。本研究中,NUEN∶C與TERC∶N顯著負(fù)相關(guān)(圖6),PUEP∶C與TERC∶P顯著負(fù)相關(guān)(圖6),可能是由于土壤微生物C利用效率與土壤微生物N和P利用效率成負(fù)相關(guān)關(guān)系[18]。

3.4 影響土壤胞外酶活性與生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的主要因子

土壤胞外酶活性與生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量受資源有效性的調(diào)控[5],本研究相關(guān)性分析表明,BG和NAG與pH顯著負(fù)相關(guān),與SWC、SOC、TN、DOC、STN、SAP、MBC、MBN顯著正相關(guān)。而LAP與pH顯著正相關(guān),與SWC、SOC、TN、DOC、STN、MBC、MBN顯著負(fù)相關(guān)(圖7)。LAP與BG和NAG呈不同的分布特征,可能是檢測(cè)方法造成了LAP與BG、NAG解耦合,BG、NAG酶活性檢測(cè)的基質(zhì)是基于MUB的,而LAP檢測(cè)的基質(zhì)則是基于AMC[2,8]。AP與TP、SAP顯著負(fù)相關(guān),受資源分配理論的影響,土壤磷酸酶活性通常與土壤有效P含量成反比,當(dāng)土壤中微生物的生長(zhǎng)受到P限制時(shí),土壤微生物將增加對(duì)磷酸酶的投資[35]。EEAC∶N與SWC顯著正相關(guān),與土壤C∶N無(wú)顯著相關(guān)性;EEAC∶P與pH顯著負(fù)相關(guān),與土壤C∶P 顯著正相關(guān);EEAN∶P與pH呈顯著負(fù)相關(guān),與土壤N∶P 顯著負(fù)相關(guān)(圖7)。研究發(fā)現(xiàn),不同的生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量與土壤化學(xué)計(jì)量的相關(guān)性不同。例如：EEAC∶N與土壤C∶N無(wú)顯著相關(guān)[34- 35]或顯著負(fù)相關(guān)[41],EEAC∶P與土壤C∶P顯著正相關(guān)[8,41]或負(fù)相關(guān)[6- 7,35],EEAN∶P與土壤N∶P 顯著正相關(guān)[40]或負(fù)相關(guān)[8,35,41]。說(shuō)明生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量與土壤化學(xué)計(jì)量的關(guān)系相對(duì)復(fù)雜,不同的生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量對(duì)土壤養(yǎng)分的響應(yīng)機(jī)理并不相同。

RDA分析表明,土壤理化性質(zhì)和微生物生物量共解釋胞外酶活性26.4%的變異,其中土壤pH、TN、SOC是土壤酶活性的顯著影響因子,分別解釋了土壤胞外酶活性14.3%、7.3%、2.2%的變異,土壤pH是影響胞外酶活性的最大解釋因子(表3)。土壤生物和非生物因子共同解釋土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量30.7%的變異,其中土壤pH、C∶P、N∶P是土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的顯著影響因子,分別解釋了土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量13.1%,5.8%,4.8%的變異,土壤pH是生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的最大解釋因子(表4)。本研究中,土壤pH是胞外酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量最主要的影響因子,原因是土壤pH通過(guò)調(diào)控土壤微生物生物量和群落組成以及酶與土壤顆粒的結(jié)合狀態(tài),從而影響土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量[42]。目前不同生態(tài)系統(tǒng)中,影響土壤酶化學(xué)計(jì)量的主要因子并不一致,例如：Xu等[7]在不同森林生態(tài)系統(tǒng)中研究發(fā)現(xiàn)土壤pH是生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的主要影響因子;王冰冰等[8]在岷江干旱地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)土壤含水率(SWC)是生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的主要影響因子;喬航等[6]在茶油人工林研究發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)碳(SOC)是生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的主要影響因子。研究發(fā)現(xiàn)土壤的非生物因子比生物因子更能影響土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量。研究不足之處,生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的RDA分析模型中各因子總解釋率并不高,造成這種結(jié)果的原因,可能是某些未檢測(cè)因子(土壤溫度、團(tuán)聚體、有機(jī)酸等)及其空間自相關(guān)間接影響了土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量的變異[6,8]。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量在不同凋落物處理下差異顯著,表現(xiàn)為葉凋落物輸入的樣地高于枝果凋落物輸入和剔除凋落物樣地,在氮添加下土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量無(wú)顯著差異,說(shuō)明凋落物的質(zhì)和量對(duì)森林土壤微生物的影響較氮添加顯著,可能氮添加對(duì)森林土壤微生物的作用機(jī)制并非一個(gè)瞬間或簡(jiǎn)單的過(guò)程。不同凋落物和氮添加處理下,土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量均未明顯偏離1∶1∶1的關(guān)系,說(shuō)明微生物應(yīng)對(duì)外界變化具有較強(qiáng)的自身調(diào)節(jié)作用。土壤微生物碳利用效率(CUE)表現(xiàn)為葉凋落物輸入的樣地低于枝果凋落物輸入和剔除凋落物樣地,TERC∶P表現(xiàn)為葉凋落物加倍和混合凋落物加倍處理高于枝果凋落物加倍和剔除凋落物處理,說(shuō)明微生物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)胞外酶和養(yǎng)分利用效率對(duì)養(yǎng)分變異做出響應(yīng),葉凋落物的輸入相對(duì)緩解了P的限制。本研究發(fā)現(xiàn)凋落物處理和氮添加下土壤的非生物因子比生物因子更能影響土壤胞外酶活性和生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量?；谕寥郎鷳B(tài)過(guò)程的復(fù)雜性,微生物對(duì)森林地表凋落物變化以及長(zhǎng)期氮添加的調(diào)控機(jī)制未來(lái)仍需繼續(xù)探討。