劉佳伊，呂欣然，李 婧，白鳳翎*，董 君，勵建榮

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 寧夏出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心 銀川750000）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生以乳酸為主要產(chǎn)物的無芽孢革蘭氏陽性細菌。乳酸菌棲息在傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜、肉制品、乳制品、動物腸道、飼料等各種自然生態(tài)環(huán)境中，形成優(yōu)勢乳酸菌后對其它微生物類群具有較強的拮抗作用。乳酸菌主要通過產(chǎn)生有機酸、乳酸菌素、羅伊菌素、過氧化氫等代謝產(chǎn)物抑制其它微生物的生長繁殖[1-2]。乳酸菌種類的多樣性決定了其拮抗機制的復(fù)雜性，主要包括乳酸菌的代謝產(chǎn)物攻擊受試對象的細胞膜，干擾受試菌的細胞代謝活性，抑制蛋白質(zhì)的合成等途徑[3-6]。

目前，乳酸菌素Nisin 的抑菌機制的研究較清晰，Nisin 的抑制對象主要是革蘭氏陽性菌，其可吸附在受試菌細胞壁合成的前體物質(zhì)——脂質(zhì)（lipid）II 上，進而抑制細胞壁的合成。此外，Nisin可插入受試菌的細胞膜上，導(dǎo)致孔的形成，打破細胞膜內(nèi)、外原有的離子梯度平衡，從而使細胞內(nèi)的氨基酸、K+、ATP 等物質(zhì)外泄[7]。Avitabile 等[8]利用圓二色光譜技術(shù)（Circular dichroism，CD）發(fā)現(xiàn)蛙皮素和天蠶素A 兩種抗菌肽通過與指示菌膜上的LPS 結(jié)合實現(xiàn)對大腸桿菌的抑制作用；Gupta 等[9-10]發(fā)現(xiàn)從面糊中分離的海氏腸球菌（Enterococcus hirae）形成的腸球菌素LD3 能夠使沙門氏菌、志賀氏菌等受體細胞形成孔洞，促使ATP 外泄和質(zhì)子電動勢損耗，導(dǎo)致受試菌死亡；Zhao 等[11]發(fā)現(xiàn)從酸菜中篩選出的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JLA-9 通過抑制菌體細胞氧化呼吸代謝活動來阻礙蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的生長。但關(guān)于乳酸菌素抑制革蘭氏陰性菌的作用機制還未完全闡述清楚，需要進一步的探究。

本文以產(chǎn)細菌素DL3 的植物乳桿菌DL3 為應(yīng)試菌，腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）為受試菌，從生長曲線、細胞膜通透性、紫外吸收物質(zhì)、細胞形態(tài)特征和蛋白質(zhì)合成等指標探究植物乳桿菌DL3 對腐敗希瓦氏菌的抑菌機理，以期為開發(fā)新的水產(chǎn)品生物防腐劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與菌株 應(yīng)試菌：植物乳桿菌DL3，分離自東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜，經(jīng)生理生化和16S rRNA鑒定，本校微生物學與分子生物學研究室保藏。受試菌：腐敗希瓦氏菌ATCC8071，上海北諾生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 LB 肉湯、MRS 培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，華藍化學有限公司；α-氰基-4-羥肉桂酸HCCA，上海恒遠生物科技有限公司；DNA marker-D、細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、Taq PCR Master mix、SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳所用試劑、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準Marker，上海生工生物工程有限公司；乙酸乙酯、石油醚（AR），天津市富宇精細化工有限公司；Quantity one 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；GENMED 細菌可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒，廣州晨展貿(mào)易有限公司。

1.1.3 設(shè)備與儀器 GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；DL-CJ-2N 型超級潔凈工作臺，東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；賽福智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R 冷凍高速離心機、Mastercycler pro 梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Cheimdox XRS 凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；UV2550-可見分光光度計，日本Shimadzu 公司；Labconco FreeZone 2.5 臺式真空冷凍干燥機，美國LABCONCO 公司；Labscale TFF System 小型切向流超濾系統(tǒng)，美國Millipore 公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜儀，上海一恒科學儀器有限公司；S-4800 掃描電鏡，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌上清液（Cell free supernatant，CFS）的制備 參照文獻[12]的方法并稍作修改，將-80℃保存的菌株DL3 在MRS 液體培養(yǎng)基中于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，活化2 代。將活化的應(yīng)試菌（植物乳桿菌DL3）接種在MRS 液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h 后于4 ℃，10 000 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)過濾獲得菌株DL3 CFS。取應(yīng)試菌CFS 經(jīng)-40 ℃真空冷凍干燥4 d，獲得凍干粉進行下一步抑菌機理研究。

1.2.2 受試菌最小抑菌濃度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）測定 采用液體二倍稀釋法[13]，用LB 液體培養(yǎng)基將CFS 制成終質(zhì)量濃度分別為32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125 mg/mL 的溶液，各取5.0 mL 為試驗組，以LB 培養(yǎng)基為對照組。接種200 μL 1.0×106CFU/mL 受試菌（腐敗希瓦氏菌）菌懸液，于30 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，以未渾濁的最低質(zhì)量濃度為受試菌的最小抑菌濃度，每組重復(fù)3 次。

1.2.3 受試菌生長曲線測定 參考Saraoui 等[14]的方法稍作修改，將200 mL 1.0×106CFU/mL 受試菌菌懸液于30 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)6 h，添加應(yīng)試菌CFS 使其終質(zhì)量濃度為0.5MIC，每隔2 h測OD600nm值，同時采用平板計數(shù)法進行活菌計數(shù)。

1.2.4 受試菌細胞膜通透性分析 參考Shen等[15]的方法稍作修改。通過電導(dǎo)率的變化分析應(yīng)試菌對受試菌細胞膜通透性的影響。在1.0×106CFU/mL 受試菌菌液中加入應(yīng)試菌CFS，終質(zhì)量濃度為0.5 MIC。于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)，每2 h 測定受試菌的電導(dǎo)率。

1.2.5 受試菌細胞外紫外吸收物質(zhì)含量檢測 參考Lv 等[16]的方法稍作修改，在1.0×106CFU/mL 的受試菌菌懸液中，加入應(yīng)試菌CFS 使其終質(zhì)量濃度 為0.5MIC，30 ℃，150 r/min 培 養(yǎng)，每2 h 測OD260nm值。

1.2.6 受試菌蛋白質(zhì)合成的分析

1.2.6.1 總蛋白質(zhì)的提取 參考Bradford[17]的方法稍作修改，用LB 液體培養(yǎng)基稀釋獲得1.0×106CFU/mL 受試菌菌懸液，加入應(yīng)試菌CFS 使其終質(zhì)量濃度為0.5MIC，于30 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)12 h，離心（6 000 r/min，10 min）得菌體細胞，用0.1 mol/L pH 7.4 PBS 洗滌3 次。采用GENME 細菌可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒提取菌蛋白。

1.2.6.2 SDS-PAGE 分析 取適量提取的菌蛋白與樣品緩沖液混合，煮沸3 min，冷卻至室溫，上樣量10 μL。電泳方法參考文獻[18]并稍作改進：分離膠10%，濃縮膠4%，濃縮膠電壓為80 mV，分離膠電壓120 mV。電泳結(jié)束后用將整塊膠在染色液（0.25%考馬斯亮藍G250）中搖床染色40 min，并在脫色液 （V甲醇∶V冰醋酸∶V蒸餾水=25∶10∶65）中脫色，直至蛋白質(zhì)條帶清晰可見。電泳結(jié)果采用Quantity One 系統(tǒng)拍照。

1.2.7 掃描電鏡觀察 參考Hovnanyan 等[19]的方法并稍作修改。以添加0.5MIC 應(yīng)試菌CFS 為處理組，以添加等體積MRS 液體培養(yǎng)基為對照組。各取0.5 MIC 應(yīng)試菌 CFS 和LB 培養(yǎng)基5.0 mL 后，分別加入200 μL 1.0×106CFU/mL 受試菌菌懸液，于30 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)12 h，離心（6 000 r/min，10 min）收集菌體。在4 ℃，2.5%戊二醛溶液中固定12 h，用無菌水洗滌3 次，除去殘留戊二醛，菌體再用無菌水懸浮。取適量菌體細胞滴于潔凈蓋玻片上，真空干燥12 h，噴金，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 受試菌MIC 測定結(jié)果

經(jīng)肉眼觀察，當應(yīng)試菌CFS 質(zhì)量濃度達到和超過8.0 mg/mL 時，受試菌均無渾濁現(xiàn)象，確定應(yīng)試菌CFS 對受試菌的MIC 為8.0 mg/mL。Yi 等[20]發(fā)現(xiàn)，從漿水中分離獲得的棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）XN8 產(chǎn)生的乳桿菌素XN8-A 對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌 （Escherichia coli）的MIC 均為6.85 mg/mL，與本試驗的研究結(jié)果相似。

2.2 應(yīng)試菌CFS 對受試菌生長曲線的影響

應(yīng)試菌CFS 對受試菌生長曲線的影響如圖1所示，與對照組相比，加入應(yīng)試菌CFS 的受試菌生長曲線出現(xiàn)增長緩慢，穩(wěn)定期延遲等現(xiàn)象，受試菌穩(wěn)定期的細胞增長量僅為對照組的二分之一，說明應(yīng)試菌CFS 能抑制受試菌的生長繁殖。與對照組相比，受試菌細胞數(shù)下降了1.16 lg（CFU/mL），結(jié)果表明植物乳桿菌對腐敗希瓦氏菌生長具有抑制作用。Zouhaier 等[21]研究表明在伊氏利斯特菌（Listeria ivanovii）BUG496 對數(shù)生長期時加入不同濃度的腸球菌素MMZ17，伊氏利斯特菌BUG496 生長受到抑制，增加腸球菌素后伊氏利斯特菌BUG496 呈穩(wěn)定生長趨勢，細胞量僅為對數(shù)生長期的四分之一，與本試驗研究結(jié)果相似。

2.3 應(yīng)試菌CFS 對受試菌細胞膜通透性的影響

分析細菌細胞膜通透性變化是了解抑菌機理的途徑之一。正常情況下，細菌的細胞膜具有一定的通透性。當細胞膜遭到破壞時，其通透性發(fā)生改變，內(nèi)部的電解質(zhì)（K+，Ca2+，Mg2+等）大量外滲至培養(yǎng)液中，細菌菌懸液中電導(dǎo)率的變化可以反映細菌細胞膜通透性的變化情況[16]。

應(yīng)試菌CFS 對受試菌電導(dǎo)率的影響如圖2所示，隨著時間的延長，20 h 時試驗組的電導(dǎo)率為34.3 ms/cm，對照組為33.1 ms/cm，試驗組明顯高于對照組。說明植物乳桿菌DL3 對腐敗希瓦氏菌細胞膜具有攻擊作用，導(dǎo)致細胞質(zhì)滲漏。趙瑞香等[22]研究表明乳酸桿菌素H2 可引起大腸桿菌菌體細胞膜通透性增大，K+大量外泄導(dǎo)致膜電位消散，與本試驗結(jié)果相似。

圖1 植物乳桿菌DL3 CFS 對腐敗希瓦氏菌生長曲線的影響Fig.1 Effects of L.plantarum DL3 CFS on the growth curves of S.putrefaciens

圖2 植物乳桿菌DL3 CFS 對腐敗希瓦氏菌電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of L.plantarum DL3 CFS on the conductivity of S.putrefaciens

2.4 應(yīng)試菌CFS 對受試菌紫外吸收物質(zhì)含量的影響

細胞膜是細胞內(nèi)、外物質(zhì)交流的通道，當細菌菌體受到抗菌物質(zhì)作用時，細胞膜受損并喪失功能。細胞膜受損后細胞內(nèi)K+和PO43-等小分子物質(zhì)外滲至胞外，隨后DNA，RNA 等大分子物質(zhì)也發(fā)生外泄。因此，測定胞外核酸物質(zhì)的含量可作為評價細胞膜完整性的指標[23]。應(yīng)試菌CFS 處理對受試菌菌體紫外吸收物質(zhì)的影響見圖3，在0～20 h范圍內(nèi)，試驗組OD260nm值比對照組增加11.95%，說明植物乳桿菌DL3 破壞了腐敗希瓦氏菌細胞膜的完整性，使胞內(nèi)核酸物質(zhì)外泄。

2.5 應(yīng)試菌CFS 對受試菌的蛋白質(zhì)合成的影響

蛋白質(zhì)泄露是評定細菌細胞膜完整性的一個重要指標[24]。經(jīng)植物乳桿菌DL3 處理的腐敗希瓦氏菌總可溶性蛋白的SDS-PAGE 圖譜如圖4所示，圖中1 道為試驗組，2 道為對照組?？梢钥闯?，與對照組相比，經(jīng)應(yīng)試菌CFS 處理的試驗組的條帶顏色變淺且數(shù)量減少，表明應(yīng)試菌CFS 處理可影響受試菌總蛋白質(zhì)的合成。Sitohy 等[25]利用大豆球蛋白處理單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）后發(fā)現(xiàn)細菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受到較大的影響。

2.6 受試菌掃描電鏡觀察

經(jīng)應(yīng)試菌CFS 處理的受試菌掃描電鏡結(jié)果見圖5，從中可以看出，對照組的受試菌菌體生長良好，表面光滑，圓潤，呈桿狀。經(jīng)應(yīng)試菌處理12 h后，菌體兩端出現(xiàn)破損，細胞原生質(zhì)發(fā)生泄漏，表明應(yīng)試菌CFS 對受試菌細胞壁具有破壞作用。Wen 等[26]通過掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)植物乳桿菌K25 處理后的蠟樣芽胞桿菌菌體細胞壁被破壞，細胞整體結(jié)構(gòu)坍塌導(dǎo)致細胞質(zhì)泄露，研究結(jié)果與本試驗相似。

3 結(jié)論

本文研究了由傳統(tǒng)東北酸菜中分離篩選出的植物乳桿菌DL3 對腐敗希瓦氏菌抑菌作用的機理，結(jié)果表明植物乳桿菌DL3 對腐敗希瓦氏菌的菌體生長具有抑制作用，經(jīng)植物乳桿菌DL3 處理的腐敗希瓦氏菌的細胞膜通透性和電導(dǎo)率同時增加，核酸物質(zhì)外泄，蛋白質(zhì)合成受到影響。掃描電鏡觀察腐敗希瓦氏菌菌體細胞壁被破壞，細胞質(zhì)發(fā)生泄漏。綜上表明植物乳桿菌DL3 通過改變菌體細胞膜的通透性，破壞細胞膜完整性，影響蛋白質(zhì)合成等方式抑制腐敗希瓦氏菌的生長繁殖。

圖3 植物乳桿菌DL3 CFS 對腐敗希瓦氏菌紫外吸收物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of L.plantarum DL3 CFS on ultraviolet absorbing compounds of S.putrefaciens

圖4 植物乳桿菌DL3 CFS 處理的腐敗希瓦氏菌總可溶性蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of total soluble proteins for S.putrefaciens treated by L.plantarum DL3 CFS

圖5 植物乳桿菌DL3 CFS 對腐敗希瓦氏菌作用的掃描電鏡結(jié)果Fig.5 SEM results of the effect of L.plantarum DL3 CFS on S.putrefaciens