王 靜，李 春，曲國強，孫雪婷，劉麗波

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室 哈爾濱150030）

OPO（1，3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯）結構脂是通過酶法酯交換生成的一種母乳化結構脂[1-2]。母乳是嬰兒生長過程中不可取代的食物[3]。然而，生活節(jié)奏的加快和個人身體狀況的不同，一些母親不能通過母乳而需借助嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒。嬰幼兒配方奶粉需求量從2013年的82.6萬t 增至2017年的110 萬t，增長了33.17%。植物油作為傳統(tǒng)嬰兒配方粉中重要組成，提供嬰兒生長的能量，然而傳統(tǒng)配方奶粉中添加的油脂中棕櫚酸主要分布在Sn-1，3 位上，被脂肪酶水解后生成的游離棕櫚酸極易與鈣離子形成不溶性的皂鈣脂肪酸，不僅造成鈣的損失，嬰兒還會出現(xiàn)大便干燥甚至便秘的情況[4]。事實上，母乳脂肪的基本成分是甘油三酯，棕櫚酸含量占17%～25%，其中高達70%的棕櫚酸在Sn-2 位上，消化后只有Sn-2位上的棕櫚酸易被腸道吸收而進入血液，進而促進嬰兒能量代謝[5-6]。研制與母乳消化后結構特性相似的結構油脂，成為目前的研究熱點和難點。越來越多的研究表明，添加母乳化OPO 結構脂的嬰幼兒配方奶粉，能有效降低皂鈣脂肪酸的形成，有利于嬰兒對脂肪酸和鈣的吸收，從而改善嬰兒大便困難、腹痛等問題[7-8]。

近年來，隨著OPO 結構脂制備工藝的成熟，市面上已出現(xiàn)很多相關產(chǎn)品。早在2008年，我國原衛(wèi)生部公告批準了營養(yǎng)強化劑OPO 結構脂可運用于嬰幼兒配方食品的文件 （2008年第13號）。直到2018年6月19日，國家認監(jiān)委發(fā)布《有機產(chǎn)品認證增補目錄（六）》公告，將OPO 結構脂收錄到有機產(chǎn)品認證目錄中。由于我國結構脂的研究起步晚，產(chǎn)品幾乎被國外企業(yè)壟斷，導致嬰兒奶粉企業(yè)OPO 結構脂添加成本高居不下，造成巨大生產(chǎn)壓力。研制出具有自主知識產(chǎn)權的結構脂，是提高嬰幼兒配方奶粉品質的關鍵技術。

OPO 結構脂的營養(yǎng)價值雖已被證實，但對于OPO 結構脂在體外的脂肪酸釋放特性卻鮮有研究，其消化機理成為近幾年的研究熱點。有研究表明，液滴粒徑越?。ū缺砻娣e越大）越有利于油脂的消化分解[9]。根據(jù)母乳脂肪酸組成特點[10]，本試驗自制OPO 結構脂，構建嬰兒體外消化模型。以混合植物油作對比，制備粒徑更小的乳液。根據(jù)消化前、后脂肪酸組成成分的變化、消化曲線的分析以及消化過程中平均粒徑和zeta 電位的變化來研究油脂在體外消化的情況[11]，為進一步研究嬰幼兒配方奶粉中脂肪的消化吸收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

OPO 結構脂，實驗室自制；高油酸葵花籽油、玉米油、菜籽油、椰子油，均為市售；胃蛋白酶（比活力1∶3 000）、胃脂肪酶（50 U/mg）、豬胰酶（100～350 U/mg）、牛膽鹽、37 種脂肪酸甲酯混標（色譜級），Sigma 公司；檸檬酸脂肪酸甘油酯，河北潤步生物科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、正己烷、甲醇、氯仿，天津市天力化學試劑有限公司；所有試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

氣相色譜質譜聯(lián)用儀GC7890/MS5975C，安捷倫（美國）有限公司；Zetasizer nano ZS 粒度分析儀及ZETA 電位儀，馬爾文公司；高剪切乳化機，美國歐姆尼公司；SPCH-10 高壓均質機，英國Stansted Fluid Power 公司；pH 計，梅特勒-托利多儀器有限公司；自動電位滴定儀，上海雷磁分析儀器廠；水浴恒溫磁力攪拌器，金壇市富瑞實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 油脂乳液的制備 OPO 結構脂（O 組）和混合植物油（Z 組）制備方法如下：

1）OPO 結構脂的制備 以PPP（三棕櫚酸甘油三酯）和?；w（椰子油、玉米油、菜籽油、高油酸葵花籽油）按物質的量比1∶4 混合，通過酶法酯交換，制成OPO 結構脂（即O 組）；

2）根據(jù)所用植物油中脂肪酸組成情況[12]，將椰子油、玉米油、菜籽油、高油酸葵花籽油按27∶26∶27∶20 比例混勻，制成混合植物油（即Z 組）。

3）油脂乳液的制備 將檸檬酸脂肪酸甘油酯以0.2%的體積分數(shù)溶解于超純水，用磁力攪拌器加熱攪拌至完全溶解，將體積分數(shù)為95%完全溶解水化的溶液分別與體積分數(shù)5%的O 組油脂和Z 組油脂混合攪拌，高速剪切乳化5 min（12 000 r/min），然后30 MPa 均質3 次，得白色乳狀液體即油脂乳液[13-14]，油脂乳液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 嬰兒體外消化模型的建立 本試驗所采用的嬰兒體外消化模型，參考Minekus 等[15]和Tagliazucchi 等[16]的研究方法并根據(jù)實際情況做調整。

模擬嬰兒胃液（SGF）的配制：準確稱取0.20 g NaCl 溶于70 mL 超純水中，用1 mol/L HCl 溶液調節(jié)溶液至pH 值為5.0，加水定容至100 mL，再加入0.45 g 胃蛋白酶（比活力1∶3 000）和0.032 g脂肪酶（50 U/mg），在恒溫37 ℃下以10 r/min 磁力攪拌10 min，將溶液混勻，即為模擬嬰兒胃液。

模擬嬰兒腸液（SIF）的配制：準確稱取0.68 g K2HPO3溶于超純水中，用1 mol/L HCl 溶液調節(jié)溶液至pH 值為6.8，加水定容至100 mL，再加入0.12 g 的膽鹽和0.10 g 胰酶，恒溫37 ℃下以10 r/min 磁力攪拌10 min，使溶液混勻，即為模擬嬰兒腸液。

1.3.3 油脂的體外消化 參照Devle 等[17]的方法并做適當修改，取10 mL 油脂乳液在37 ℃恒溫水浴鍋中溫浴10 min，加入5 mL 模擬胃液，攪拌均勻，于37 ℃，95 r/min 下恒溫水浴攪拌消化30 min，期間用0.10 mol/L NaOH 溶液滴定，中和水解釋放出的脂肪酸，記錄不同時間滴加的NaOH溶液的體積。調節(jié)模擬胃液中消化后的溶液pH值至6.8，加入10 mL 模擬腸液，在37 ℃，95 r/min 下恒溫水浴攪拌2 h 模擬小腸消化，期間用0.10 mol/L NaOH 溶液滴定，中和水解釋放出的脂肪酸，記錄不同時間NaOH 溶液消耗的體積。每個樣品各做3 次重復。

1.3.4 油脂體外消化過程中脂肪酸釋放率的測定測定油脂乳液在消化過程中脂肪酸的釋放率可以反映出其消化率和消化程度，脂肪酸的釋放率根據(jù)消化過程中消耗的NaOH 溶液體積來計算，計算公式如下[18]：

式中：C0——NaOH 溶液的濃度 （0.1 mol/L）；VC——消耗NaOH 溶液的總體積（mL）；m——油脂乳液中加入樣品的質量（g）；M——樣品的平均分子質量（g/moL）。

1.3.5 油脂平均粒徑和粒徑分布的測定 采用靜態(tài)光散射技術，利用Nano-ZS90 粒度分析儀測定油脂乳液粒徑。將油脂乳液稀釋10 倍，混合均勻后取1 mL 進行測定。測定溫度為25 ℃，分散劑為水，折射率為1.056。每個樣品平行測定3 次[19]。

1.3.6 油脂zeta 電位的測定 將乳液樣品稀釋10 倍后采用Nano-ZS 電位測定儀測定2 組油脂乳液的zeta 電位。上樣量為1 mL，測定溫度為25℃，每個樣品平行測定3 次[20]。

1.3.7 消化后乳液的脂肪酸分析

1.3.7.1 脂肪酸的甲酯化[21]

1）取樣品100 mg 于圓底燒瓶中，加入8 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，連接回流冷凝器，80 ℃水浴回流20 min。

2）從冷凝器上端加入7 mL 0.50 mol/L 硫酸甲醇溶液，繼續(xù)于80 ℃水浴回流15 min，停止加熱，取下燒瓶，冷水浴使其快速冷卻至室溫。

3）準確量取20 mL 正己烷加入圓底燒瓶中，振蕩2 min，再加入飽和NaCl 水溶液，靜置分層，吸取約10 mL 上層有機相于試管中。

4）往試管中加入3 g 無水硫酸鈉，吸收殘留水分，振蕩均勻，靜置10 min，吸取上層溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾至進樣瓶中用于氣相分析。

1.3.7.2 氣相色譜檢測條件 使用安捷倫GC7890/MS5975C 對樣品進行定性和定量分析。儀器的工作條件為：色譜柱：毛細管柱hp-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；升溫程序：70 ℃保持5 min，以5 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min 升至280，保持25 min；進樣量：1 μL；不分流模式，流量50 mL/min；載氣：氦氣，流速1.0 mL/min。質譜條件：離子源為EI；質譜掃描范圍為m/z 50～500；電子能70 eV；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲時間4 min，四級桿溫度150℃。

1.3.7.3 油脂的Sn-2 位脂肪酸測定 測定油脂的Sn-2 位脂肪酸分布首先需要對其進行酶解，根據(jù)胰脂酶具有專一水解Sn-1，3 位上的脂肪酸的性質，用豬胰酶對樣品進行水解，之后采用薄層色譜法對Sn-2 位脂肪酸進行分離純化，再使用氣相色譜法測定Sn-2 位脂肪酸的組成[22]，色譜條件同1.3.7.2 節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與討論

2.1 油脂的脂肪酸組成分析及Sn-2 位脂肪酸分布

資料研究表明：脂肪的消化率與它的飽和度有關，一般而言，飽和度與消化率成反比，即飽和度越低消化率越高[23]。本試驗制備的O 組和Z 組油脂中脂肪酸組成如表1所示。由表可知，在2 組油脂中，占比例較大的游離脂肪酸主要是棕櫚酸、油酸、亞油酸，O 組棕櫚酸占（21.73±0.75）%、油酸占（37.71±0.45）%、亞油酸占（22.43±1.01）%；Z 組棕櫚酸占（26.43±0.61）%、油酸占（31.48±1.08）%、亞油酸占（23.62±0.31）%，與蔣與燕[10]描述的母乳脂肪中各脂肪酸種類大致相同。不同的是，O 組棕櫚酸含量與母乳更相近，Z 組棕櫚酸含量較高，對比表2可知，O 組可被嬰兒吸收的棕櫚酸比Z 組高10%，O 組不飽和脂肪酸含量為60.14%，高于Z組不飽和脂肪酸含量（55.1%）；因此可推斷在模擬胃腸道消化時，O 組比Z 組表現(xiàn)出更高的消化率。

表1 母乳及2 種油脂乳液的脂肪酸組成（%）Table 1 Fatty acid composition of breast milk and two oil emulsions （%）

表2中描述了Sn-2 位脂肪酸分布及含量情況，由表可知，O 組Sn-2 棕櫚酸含量為（39.93±1.21）%，與母乳更接近，Z 組Sn-2 位棕櫚酸含量僅為（19.84±1.02）%，O 組與Z 組具有顯著性差異（P＜0.05）。對比2 種油脂乳液和母乳中Sn-2 位脂肪酸分布，發(fā)現(xiàn)Sn-2 位脂肪酸分布差別較大，母乳中Sn-2 位脂肪酸主要為棕櫚酸，而O 組油脂中Sn-2 位脂肪酸為棕櫚酸、油酸和亞油酸且含量較高，Z 組油脂Sn-2 位脂肪酸主要為油酸、亞油酸。

表2 母乳及2 種油脂中Sn-2 位脂肪酸分布（%）Table 2 Distribution of Sn-2 fatty acids in breast milk and two oil （%）

2.2 油脂平均粒徑分布

不同結構的物質在形成乳化液之后形成的體系顆粒大小不同，不同的乳化狀態(tài)則影響了體外消化過程中酶與底物結合的效率[24]。本試驗利用納米粒度儀測定O 組和Z 組油脂乳液在模擬嬰兒體外胃腸道消化前的平均粒徑分布（圖1）。

由圖1可知，O 組的平均粒徑相對較小，大多分布在（198±9.72）nm 處，而Z 組的平均粒徑集中分布在（229±15.61）nm 處，說明在消化初始階段O 組油滴暴露出來的比表面積比Z 組大，較大的比表面積為與脂肪酶快速結合提供了重要條件，從而表現(xiàn)出較快的消化速率及較高的脂肪酸釋放率。與其它研究相比，本試驗所制備的油脂粒徑更小，相關研究表明，液滴粒徑越小（比表面積越大）越有利于油脂的消化分解[9]。

2.3 油脂消化曲線的分析

油脂在消化過程中會釋放脂肪酸和單甘酯，消化過程中不同時間段的脂肪酸釋放率可以反映出油脂的消化速率和消化程度。本試驗測定了O組和Z 組在消化150 min （模擬胃液中消化30 min 和模擬腸液中消化120 min）過程中不同時間的脂肪酸釋放率，結果如圖2。

由圖2可知，在整個消化過程中2 組樣品脂肪酸的釋放率都呈先增大后平穩(wěn)的趨勢，這說明在消化初期油滴與酶等物質結合，加快了消化速率，但隨著消化時間的延長，2 組的油脂消化速率均趨于平穩(wěn)。

在模擬胃液消化時，O 組脂肪酸的釋放率高于Z 組，此時O 組脂肪酸釋放率為（12.83±1.35）%，Z 組為（8.92±1.68）%，具有顯著性差異（P＜0.05）。在相同條件下，油滴粒徑大小應與消化釋放率呈負相關，由于O 組平均粒徑較Z 組小13.54%，比表面積較大，增加酶反應的底物位點，更有利于與酶結合發(fā)生反應，因此提高了脂肪酸的釋放率。

圖1 油脂的平均粒徑分布Fig.1 Average particle size distribution of oil

圖2 油脂在模擬胃腸液消化過程中的脂肪酸釋放率Fig.2 Fatty acid release rate of oil in simulated gastrointestinal fluid digestion

圖2結果表明，在模擬胃腸液中消化30～60 min 時，2 組乳液樣品脂肪酸的釋放率迅速上升，其中O 組釋放率達到 （61.63±2.57）%，Z 組為（50.71±1.94）%，原因可能是由于胃液消化產(chǎn)物的附著以及膽鹽等的強乳化作用將油滴乳化成細小的乳糜微粒，增大了酶與底物的接觸面積，使得專一性酶胰脂肪酶可以很好地與油滴結合，從而破壞油滴結構，使脂肪酸釋放率迅速增加。OPO 結構油脂的Sn-2 位主要是飽和脂肪酸 （棕櫚酸），Sn-1，3 位上連接的主要是不飽和脂肪酸，而普通油脂則相反[25]，由于腸液中含有的胰脂肪酶是Sn-1，3 位專一性酶，因此，O 組油脂飽和度比Z 組低，可推測出O 組的脂肪酸釋放率更高，與圖中結果相符。

在模擬胃腸液中消化90 min 后，2 組乳液的釋放率都逐漸趨于平穩(wěn)，可能是隨著模擬嬰兒胃腸道消化環(huán)境中的脂肪酶的逐漸耗盡，導致消化進程基本停滯，脂肪酸的釋放率幾乎不變。從消化程度來看，O 組脂肪酸最終釋放率為（62.67±3.21）%，而Z 組最終釋放率為（51.83±0.98）%，高于Devle 等[17]描述的單一油脂的消化率，且O 組與Z 組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 油脂在消化過程中平均粒徑的變化

本試驗測得2 組油脂消化過程中平均粒徑的變化情況如圖3所示。

圖3 油脂在體外模擬消化過程中平均粒徑的變化Fig.3 Changes in average particle size of oil during simulated digestion in vitro

由圖3可知，在消化初始階段和模擬胃液中消化30 min 后，O 組平均粒徑均小于Z 組，粒徑大小與消化速率有關，粒徑越大，對應的消化速率越小[26]，與消化曲線相符。脂肪在胃中進行的只是初步水解，其主要的消化作用在小腸中進行[27]。

在模擬胃腸液中消化60 min 后，O 組平均粒徑為（1 004.83±17.75）nm，Z 組為（931.29±20.53）nm，O 組和Z 組具有顯著性差異（P＜0.05），這可能是由于腸液中含有能夠特異性水解OPO 結構脂的專一性胰脂酶，而其特殊結構使得油滴與酶、膽鹽等物質的親和力更強[28]。在模擬胃腸液中消化90 min 后，2 組油脂的平均粒徑繼續(xù)增大，此時O組平均粒徑為（1 203.42±20.52）nm，Z 組平均粒徑為（1 149.81±32.06）nm，可能是由于消化產(chǎn)物和酶、膽鹽等物質包裹在油滴的表面，使粒徑繼續(xù)增大[23]。消化120 min 后，2 組油脂的平均粒徑均有所降低，可能是在膽鹽的作用下，使得被消化的油滴分子再次乳化，乳液平均粒徑變小[29]。之后隨著消化時間的延長，2 組乳液的平均粒徑呈現(xiàn)出大致平穩(wěn)現(xiàn)象，原因可能是隨著模擬嬰兒胃腸道消化環(huán)境中脂肪酶的耗盡，油滴表面包裹的物質達到飽和，脂肪酸的釋放速率與物質的粘連速率相同，導致兩者的平均粒徑變化不大。

2.5 油脂在消化過程中zeta 電位的變化

本試驗測得2 組油脂消化過程中zeta 電位的變化情況如圖4所示。

圖4 油脂在體外模擬消化過程中電位變化Fig.4 Potential changes of oil in simulated digestion in vitro

測定體外消化過程中乳液的zeta 電位可以反映出油滴表面組成的變化，一般情況下，液體體系的電位小于-30 mV 時，說明體系中顆粒之間的靜電排斥力越強，體系越穩(wěn)定[30]。由圖4可知，2 組油脂乳液均帶負電荷，且在消化初始階段的zeta 電位均處于-30～-45 mV 之間，說明乳液處于穩(wěn)定狀態(tài)。在消化過程中2 組油脂乳液的電位均呈先增大后平穩(wěn)的趨勢。

在模擬胃液中消化30 min 后，O 組電位由初始電位 （-37.71±1.37）mV 變?yōu)?（-36.02±1.21）mV，而Z 組電位由（-40.29±2.61）mV 變?yōu)椋?34.62±2.47）mV，說明在這個階段，O 組油滴表面的電荷量變化并不顯著（P＞0.05），而Z 組油滴表面的電荷量變化較顯著（P＜0.05），因此，在這一過程中O 組電位變化較小，相對較穩(wěn)定。

進入模擬胃腸液消化60 min 后，Z 組電位為（-31.74±1.21）mV，變化并不顯著（P＞0.05），O 組電位為（-29.16±0.85）mV，與在模擬胃液中相比變化顯著（P＜0.05），究其原因可能是由于腸液中含有的胰脂酶能夠特異性水解OPO，破壞了油滴結構，使得表面的負電荷迅速減少，顆粒間的靜電斥力減小，體系的電位增大。由于胰脂肪酶是等電點為5.0 的酸性蛋白，在模擬腸液中帶負電荷，因此可以排除由胰脂肪酶吸附在乳液微粒上造成電位變化的因素[31]。進入模擬胃腸液中消化90 min 之后，隨著消化時間的延長，2 種乳液的電位均趨于平穩(wěn)，原因可能是在消化過程中模擬嬰兒胃腸道體系中脂肪酶的消耗，油滴表面的附著物達到飽和，使得油滴表面的電荷量基本保持不變，電位趨于平穩(wěn)。

2.6 油脂消化后的脂肪酸組成分析

油脂中的脂肪酸具有特定的生理功能，經(jīng)消化后釋放的脂肪酸種類和數(shù)量不同，人體對其吸收也會有差異[32]。表3為本試驗測定的2 種油脂在體外模擬消化后的產(chǎn)物中游離脂肪酸和甘油單酯的脂肪酸組成情況。

由表3可知，2 組油脂乳液消化后產(chǎn)生的游離脂肪酸和甘油單酯的種類基本相同。其中O 組游離脂肪酸中占較高比例的主要是油酸 （41.21±3.63）%、棕櫚酸（21.23±1.02）%、亞油酸（14.81±1.24）%，Z 組游離脂肪酸中油酸占 （30.63±2.86）%，棕櫚酸占（31.71±1.73）%，亞油酸占（18.69±0.94）%，由此可見2 組油脂消化產(chǎn)生的脂肪酸在含量上具有顯著性差異（P＜0.05），且O 組中不飽和脂肪酸含量與母乳消化后不飽和脂肪酸含量[33]更接近。

O 組生成的甘油單酯主要是棕櫚酸甘油單酯、油酸甘油單酯和十四碳酸甘油單酯，Z 組生成的甘油單酯主要有棕櫚酸甘油單酯、油酸甘油單酯和亞麻酸甘油單酯。從飽和度上看，O 組生成飽和脂肪酸甘油單酯 （棕櫚酸甘油單酯）較多，占（47.23±1.62）%，而Z 組棕櫚酸甘油單酯含量較少，僅占（19.02±1.29）%，因此，O 組中Sn-2 位棕櫚酸含量更高，較Z 組相比更易被嬰兒腸道吸收。

表3 體外模擬消化后的乳液中脂肪酸組成（%）Table 3 Fatty acid composition in emulsion after in vitro simulated digestion （%）

3 結論

本試驗通過制備OPO 母乳化結構油脂，模擬嬰兒體外胃腸道消化環(huán)境，測定OPO 母乳化結構油脂與普通植物油脂在在體外胃腸道消化過程中脂肪酸釋放率、粒徑及zeta 電位的變化，從而分析OPO 結構脂在消化過程中脂肪酸釋放特性。主要得出結論如下：首先，在模擬消化初始階段，OPO油脂組與混合植物油組相比，分子粒徑在預期范圍內分布更加合理；其次，OPO 油脂組Sn-2 位棕櫚酸含量比普通植物油脂含量高，且與母乳更接近，在模擬嬰兒體外消化過程中表現(xiàn)出較高的脂肪酸釋放率；此外，通過對比2 組油脂消化后的消化產(chǎn)物中脂肪酸和甘油單酯的含量，發(fā)現(xiàn)OPO 油脂組生成的游離不飽和脂肪酸和棕櫚酸甘油單酯含量較高，更易于嬰兒消化吸收，而混合植物油組則生成較多游離的飽和脂肪酸和不飽和亞油酸甘油單酯。本研究表明，與混合植物油相比，試驗制備的OPO 結構脂，消化釋放率高，脂肪酸組成更接近母乳，為母乳化脂肪在嬰兒配方粉中的良好應用奠定了重要的技術基礎。