郝 帥，李前程，李 爽，劉媛璞，王 靜，王成濤

（北京市食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京100048）

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，具有很高的發(fā)病率和致死率[2]。其中，作為肺癌的一種亞型，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)病率高達(dá)85%[3]，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。不僅如此，非小細(xì)胞肺癌還具有較高的浸潤(rùn)能力和術(shù)后復(fù)發(fā)率。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療仍然面臨許多挑戰(zhàn)。

藻藍(lán)色素蛋白（C-Phycocyanin，C-PC）是一種源于螺旋藻、藍(lán)藻細(xì)胞中的捕光蛋白，在藻體細(xì)胞內(nèi)以六聚體的結(jié)構(gòu)存在[4]，吸收光譜為615～640 nm[5]。在GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，藻藍(lán)被列為我國(guó)允許使用的天然食品著色劑，可用于飲料、糕點(diǎn)、糖果等食品生產(chǎn)中。除了能作為食用色素廣泛用于食品行業(yè)，藻藍(lán)色素蛋白同時(shí)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理功能[6]。目前，有報(bào)道證實(shí)藻藍(lán)蛋白對(duì)包含肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞系具有促進(jìn)凋亡，抑制增殖遷移的作用[7-11]。例如，Pardhasaradhi 等[8]發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白對(duì)組織細(xì)胞瘤AK-5 細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用；Subhashini 等[9]發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能夠促進(jìn)慢性白血病細(xì)胞K562 的凋亡；Liao 等[10]則通過(guò)研究證實(shí)了藻藍(lán)蛋白對(duì)胰腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制效應(yīng)?？v觀目前的研究現(xiàn)狀，大量的研究表明藻藍(lán)蛋白具有非常優(yōu)良的腫瘤抑制作用，而對(duì)于其中調(diào)控機(jī)制的報(bào)道還非常少。鑒于藻藍(lán)蛋白所具有的天然、安全、抗腫瘤等優(yōu)良特性，深度研究其抗癌調(diào)控機(jī)制具有重要意義，可為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞具有促凋亡、抑增殖的作用[7]，具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。為了探究藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控機(jī)理，本文以高通量檢測(cè)技術(shù)為手段，對(duì)藻藍(lán)蛋白處理過(guò)的H1299 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選潛在的調(diào)控靶點(diǎn)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖能力。本研究結(jié)果為深入揭示藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制，以及為功能性食用色素的抗腫瘤治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類(lèi)非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299 細(xì)胞系（以下簡(jiǎn)稱(chēng)H1299 細(xì)胞系）由本實(shí)驗(yàn)室（北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心）保存；藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000，美國(guó)Invitrogen公司；TIRAP 多克隆抗體，美國(guó)Immunoway 公司；NF-κB 信號(hào)通路抗體試劑盒、Bax/Bcl-xL 多克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；TIRAP siRNA、Negative control siRNA （Neg.siRNA），上海吉瑪制藥有限公司，其中siRNA 序列設(shè)計(jì)如表1。

表1 siRNA 序列Table 1 Sequences of siRNA segments

1.2 儀器與設(shè)備

CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；Phantom9900XL掃描儀，MICROTEK 公司；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Heraeus Eppendorf 公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD 公司；X-Ray 洗片機(jī)，上海德沐泰鈳科貿(mào)有限公司；NANODROP2000 濃度測(cè)定儀、高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；恒溫水浴振蕩器、超凈臺(tái)，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) H1299 細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期傳代，將用于試驗(yàn)的細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整至最佳。

1.3.2 細(xì)胞的siRNA 轉(zhuǎn)染 將適量細(xì)胞鋪于六孔板、60 mm 培養(yǎng)皿過(guò)夜培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備適量無(wú)RNA 酶的進(jìn)口EP 管，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)操作，取適量Lipofectamine 3000（使用前輕輕搖勻），用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋?zhuān)p輕混和。在另一EP 管中取適量TIRAP siRNA，用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋?zhuān)p輕吹打混合，隨后將兩管混合物混勻。室溫孵育10 min，最后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴加到細(xì)胞中，培養(yǎng)48～72 h 用于后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染時(shí)，同時(shí)設(shè)置Negative siRNA 轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照組。

1.3.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 采用MTT 法測(cè)定H1299 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入含有10% MTT 的完全培養(yǎng)基100 μL，放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，再加入同體積的SDS-HCL 裂解液，12 h 后測(cè)定570，630 nm 處吸光值。以630 nm 吸光值作為參考，每組4 個(gè)副孔作為平行，連續(xù)檢測(cè)6 d 吸光值，記錄數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 倒置顯微鏡觀察H1299 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化配制含4.8 μmol/L 濃度的藻藍(lán)蛋白的培養(yǎng)基，處理H1299 細(xì)胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)基并用PBS 洗滌2 次，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，拍照保存。同樣，沉默TIRAP 的H1299 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，當(dāng)出現(xiàn)形態(tài)變化時(shí)，拍照保存。

1.3.5 定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)TIRAP 基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá) TRIZOL 法提取轉(zhuǎn)染TIRAP siRNA，Neg.siRNA 的H1299 細(xì)胞的總RNA，在超凈臺(tái)中吹干RNA，加入適量DEPC 水溶解，反復(fù)吹打混勻，使RNA 充分溶解。根據(jù)濃度計(jì)算2 μg 質(zhì)量的RNA 體積，作為反轉(zhuǎn)錄cDNA 的模板，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，加入5×gDNA Buffer 2 μL，再用DEPC 水補(bǔ)齊到10 μL，簡(jiǎn)短離心，放置42 ℃，孵育3 min，加入下一步的Mix。Mix 體系為10×FastRT Buffer 2 μL，RT EnzymeMix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，4 ℃保存。剩余RNA可放于-80 ℃冰箱保存。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，程序設(shè)置采用3 步法，設(shè)計(jì)引物序列如表2（GAPDH 為內(nèi)參基因）。

表2 用于定量PCR 的引物序列Table 2 Primer sequences of qRT-PCR

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn) （Western Blot）利用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，首先收集試驗(yàn)細(xì)胞，加入適量體積的RIPA 裂解液，冰上裂解1 h，期間每隔10～15 min 混勻一次，使細(xì)胞裂解充分。4 ℃離心45 min，小心吸出上層蛋白清液，取適量蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定，利用Bradford 法測(cè)定其濃度。取出適量蛋白用于免疫印跡試驗(yàn)，其余蛋白分裝好放入-80 ℃冰箱保存。配置體積分?jǐn)?shù)12%的SDS 膠，將Marker、對(duì)照組、試驗(yàn)組蛋白依次進(jìn)行上樣，設(shè)定80 V 電壓開(kāi)始電泳，當(dāng)?shù)鞍兹繌臐饪s膠跑到分離膠時(shí)，設(shè)定120 V 電壓繼續(xù)蛋白電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，350 mA 轉(zhuǎn)膜1.5 h，隨后根據(jù)目的條帶大小剪膜，隨后用5%脫脂奶粉封閉目的條帶1.5 h、孵育一抗過(guò)夜。第2 天TBST 溶液清洗3 次，每次15 min，37 ℃恒溫靜置孵育二抗1 h，再經(jīng)TBST 溶液清洗3 次，孵發(fā)光液顯色，洗片機(jī)曝光目的條帶蛋白，掃描儀掃描膠片并保存圖片。

1.3.7 H1299 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析 分別采用藻藍(lán)蛋白（試驗(yàn)組）和PBS 溶液（對(duì)照組）處理正常培養(yǎng)的H1299 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞并提取總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?；虮磉_(dá)量基于FRKM 的方法進(jìn)行計(jì)算，獲得基因表達(dá)量FRKM 值。基因的差異比對(duì)采用DESeq 軟件進(jìn)行分析，對(duì)DESeq 檢測(cè)結(jié)果按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)（差異基因的表達(dá)量變化高于2 倍且FDR 值小于0.05）進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)基因顯著性差異表達(dá)上下調(diào)的情況。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 柱狀圖和折線圖中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，標(biāo)準(zhǔn)差采用Excel 進(jìn)行方差分析計(jì)算得到。顯著性分析采用Excel 進(jìn)行Student t-test 檢驗(yàn)計(jì)算P 值，其中當(dāng)P＜0.05 則認(rèn)定為顯著性差異（*），當(dāng)P＜0.01 則認(rèn)定為極顯著差異（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞凋亡

首先對(duì)藻藍(lán)蛋白處理后H1299 細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行了驗(yàn)證。圖1顯示，H1299 細(xì)胞經(jīng)藻藍(lán)蛋白作用48 h 后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰，藻藍(lán)蛋白處理組細(xì)胞尾部伸長(zhǎng)成不規(guī)則梭狀，細(xì)胞活力降低，肉眼可見(jiàn)有少量漂浮細(xì)胞。此外，對(duì)細(xì)胞凋亡經(jīng)典蛋白Bax，Bcl-xL 進(jìn)行了蛋白水平檢測(cè)，結(jié)果顯示藻藍(lán)蛋白處理后引起細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax 上調(diào)，抑凋亡蛋白BclxL 下調(diào)。綜上所述，此結(jié)果驗(yàn)證了藻藍(lán)蛋白對(duì)H1299 細(xì)胞的促凋亡誘導(dǎo)作用，為后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of C-Phycocyanin on apoptosis of NSCLC H1299 cells

2.2 藻藍(lán)蛋白處理H1299 細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果

為了探究藻藍(lán)蛋白在H1299 細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)藻藍(lán)蛋白處理后的H1299 細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組差異基因分析。如圖2所示，轉(zhuǎn)錄組共篩選出了1 521 個(gè)差異基因，其中710 個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因 （紅色點(diǎn)表示），811 個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因（綠色點(diǎn)表示）。這些差異基因中，TIRAP 是本試驗(yàn)篩選得到的一個(gè)感興趣的基因，在藻藍(lán)蛋白處理后出現(xiàn)顯著下調(diào)，下調(diào)比例約為60%。研究表明，TIRAP 是一個(gè)含有TIR 結(jié)構(gòu)域的適配蛋白，可與MyD88 蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活、調(diào)控NF-κB 并參與對(duì)細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡的調(diào)控。作為一個(gè)細(xì)胞活性調(diào)控因子，我們推測(cè)TIRAP 可能在藻藍(lán)蛋白介導(dǎo)的誘導(dǎo)H1299 細(xì)胞凋亡過(guò)程中參與重要的作用，因此，為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，本研究對(duì)藻藍(lán)蛋白的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了更深入的研究。

2.3 差異基因TIRAP 的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平驗(yàn)證

轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示TIRAP 為藻藍(lán)蛋白處理后的一個(gè)差異基因，隨后采用定量PCR 和免疫印跡的方法對(duì)差異基因TIRAP 進(jìn)行了生物學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果如圖3所示，藻藍(lán)蛋白處理后，H1299 細(xì)胞中TIRAP 的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了顯著下調(diào)，與對(duì)照組相比，下調(diào)比例約為40%；同時(shí)，免疫印跡結(jié)果顯示，藻藍(lán)蛋白處理后，H1299 細(xì)胞中TIRAP 的蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)了顯著降低。以上結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能夠抑制非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞中TIRAP的表達(dá)，這也進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄組的篩選結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.4 siRNA-TIRAP 轉(zhuǎn)染H1299 細(xì)胞對(duì)TIRAP表達(dá)的影響

為了探究TIRAP 是否與非小細(xì)胞肺癌H1299 的凋亡相關(guān)，本研究采用RNA 干擾技術(shù)，對(duì)H1299 細(xì)胞進(jìn)行了siRNA-TIRAP 小片段的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，以期干預(yù)TIRAP 的表達(dá)，圖4顯示了轉(zhuǎn)染siRNA 后細(xì)胞中TIRAP 表達(dá)水平的變化結(jié)果。由圖中可以看出，H1299 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 后，TIRAP 的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了極顯著下調(diào)，與對(duì)照組相比，下降比例達(dá)到90%左右；同時(shí)，免疫印跡結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染siRNA 后，細(xì)胞內(nèi)TIRAP 的表達(dá)量明顯降低。以上結(jié)果充分表明，siRNA-TIRAP 小干擾片段在H1299 細(xì)胞中作用明顯，顯著干預(yù)了TIRAP 的表達(dá)，為后續(xù)的試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

2.5 H1299 細(xì)胞沉默TIRAP 后對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

圖2 藻藍(lán)蛋白處理H1299 細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組分析Fig.2 Transcriptome analysis of H1299 cells after treatment with C-Phycocyanin

圖3 差異基因TIRAP 的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平驗(yàn)證Fig.3 Validation of TIRAP expression by qRT-PCR and Western blotting analysis

首先對(duì)轉(zhuǎn)染siRNA 后的H1299 細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，H1299細(xì)胞沉默TIRAP 后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)非正常改變，細(xì)胞輪廓不清晰，兩端伸長(zhǎng)成不規(guī)則形狀，并且伴隨著大量漂浮的細(xì)胞，此結(jié)果與藻藍(lán)蛋白處理H1299 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化基本一致（圖1）。由此初步證實(shí)TIRAP 參與了藻藍(lán)蛋白介導(dǎo)的促進(jìn)H1299 細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

圖4 siRNA-TIRAP 轉(zhuǎn)染H1299 細(xì)胞對(duì)TIRAP表達(dá)的影響Fig.4 Effect of siRNA-TIRAP transfection on the expression of TIRAP in H1299 cells

圖5 沉默TIRAP 對(duì)H1299 細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of siRNA-TIRAP transfection on the morphology of H1299 cells

圖6 沉默TIRAP 對(duì)H1299 細(xì)胞體外增殖能力的影響Fig.6 Effect of siRNA-TIRAP on the in vitro proliferation of H1299 cells

2.6 H1299 細(xì)胞沉默TIRAP 后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

采用MTT 法對(duì)H1299 細(xì)胞的體外增殖能力進(jìn)行了考察。由圖6可知，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-TIRAP 后，H1299 細(xì)胞從第2 天起生長(zhǎng)開(kāi)始受到顯著抑制，在隨后的檢測(cè)中，細(xì)胞增殖抑制效果更加明顯。此結(jié)果表明，干預(yù)TIRAP的表達(dá)對(duì)H1299 細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制效果，間接證明了TIRAP 在H1299 細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用。

2.7 免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)沉默TIRAP 后H1299細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證沉默TIRAP 能引起H1299細(xì)胞的凋亡，本研究對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組比較，沉默TIRAP 組細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)量顯著上調(diào)，而抑凋亡蛋白Bcl-xL 出現(xiàn)顯著下調(diào)，以上結(jié)果與藻藍(lán)蛋白處理H1299 細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá)情況基本一致，充分證實(shí)了藻藍(lán)蛋白能夠通過(guò)下調(diào)TIRAP 的表達(dá)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌H1299 細(xì)胞的凋亡。

2.8 H1299 細(xì)胞沉默TIRAP 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的影響

圖7 H1299 細(xì)胞沉默TIRAP 后凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)Fig.7 Analysis of apoptosis-related protein expressions in H1299 cells after transfected with siRNA-TIRAP

前期結(jié)果證實(shí)了藻藍(lán)蛋白能夠通過(guò)下調(diào)TIRAP 表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)H1299 細(xì)胞凋亡，但具體的調(diào)控途徑仍不太明確。NF-κB 是一類(lèi)多功能的核轉(zhuǎn)錄因子[14-15]，包括控制抗凋亡基因和促凋亡基因表達(dá)[16]，研究表明，抑制NF-κB 通路的活化能抑制腫瘤發(fā)展[17]。IKKα 和IKKβ 蛋白被磷酸化后，可以催化通路抑制蛋白IκBα 發(fā)生磷酸化，磷酸化的IκBα 參與蛋白酶體依賴(lài)性的降解過(guò)程，進(jìn)而與p65 蛋白發(fā)生解離，p65 蛋白隨后被磷酸化激活，進(jìn)入細(xì)胞核參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，激活NF-κB 信號(hào)通路[18]。本文對(duì)沉默TIRAP 后H1299 細(xì)胞的NFκB 信號(hào)通路進(jìn)行了蛋白水平檢測(cè)。如圖8為NFκB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，沉默TIRAP 后，IKKα、IKKβ 以及p65 蛋白的總量變化不大，但它們的磷酸化水平（p-IKKα/β、p-IκBα 和p-p65）都有明顯下調(diào)，說(shuō)明NF-κB通路的活性受到了抑制。以上研究結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能夠抑制TIRAP 蛋白的表達(dá)，通過(guò)降低NFκB 信號(hào)通路的活性而誘導(dǎo)H1299 細(xì)胞的凋亡。本研究能夠?yàn)榉切〖?xì)胞肺癌的治療和藻藍(lán)類(lèi)功能性食用色素的開(kāi)發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。

圖8 H1299 細(xì)胞沉默TIRAP 對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.8 Effect of siRNA-TIRAP transfection on the activity of NF-κB pathway in H1299 cells

3 結(jié)論與討論

食用色素是食品添加劑的一個(gè)重要門(mén)類(lèi)，運(yùn)用于各類(lèi)食品行業(yè)中。藻藍(lán)色素蛋白作為一種公認(rèn)的食用藍(lán)色素，與目前被人們所熟知的醇溶性靛藍(lán)色素相比，顏色更加鮮亮，且具有良好的水溶性，因此有著更加廣泛的應(yīng)用前景。此外，考慮到化學(xué)合成色素的安全性問(wèn)題，天然食用色素具有“綠色、環(huán)保”等優(yōu)點(diǎn)，迎合了廣大消費(fèi)者的需求。

藻藍(lán)色素蛋白的功能特性是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，目前已有相關(guān)研究報(bào)道了藻藍(lán)蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用。例如，Madamwar 等[19]證實(shí)了藻藍(lán)蛋白具有促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞凋亡的能力；Baudelet 等[20]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能夠抑制肺癌、黑色素瘤以及乳腺癌細(xì)胞的增殖。此外，一些研究者也對(duì)藻藍(lán)蛋白與其它抗腫瘤物質(zhì)的聯(lián)合作用進(jìn)行了研究，例如，Li 等[21-22]發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白與全反式維甲酸具有協(xié)同作用，能夠誘導(dǎo)肺癌A549 細(xì)胞的凋亡；Bingula 等[23]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白和甜菜堿的聯(lián)合作用也能夠抑制A549 細(xì)胞的增殖能力。本團(tuán)隊(duì)前期的研究結(jié)果也表明，除A549 細(xì)胞外，藻藍(lán)蛋白也對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299，H460 以及LTEP-a-2 細(xì)胞具有促凋亡作用[7]。但是，目前的研究幾乎沒(méi)有對(duì)藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行報(bào)道，僅僅從表型層面了解其抗肺癌效應(yīng)極大地約束了藻藍(lán)蛋白的深度應(yīng)用，搜尋藻藍(lán)蛋白的特異性調(diào)控靶點(diǎn)能夠?yàn)榉伟┑陌邢蛑委熖峁┲匾乃悸贰?/p>

本研究以H1299 細(xì)胞為模型，探究藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)其凋亡的作用機(jī)制，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組篩選出了一個(gè)潛在的調(diào)控靶點(diǎn)TIRAP。TIRAP 蛋白在細(xì)胞中主要是參與MyD88 依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，當(dāng)特異性激活TLR2 或TLR4 時(shí)，TIRAP 首先移位至細(xì)胞膜并通過(guò)其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-biphosphate，PIP2）結(jié)構(gòu)域與PIP2 結(jié)合，然后再通過(guò)保守的TIR（Toll/interleukin 1 receptor domain-containing）結(jié)構(gòu)域與MyD88 蛋白結(jié)合并將其募集至TLR 受體，繼而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24-25]。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染小干擾RNA 將TIRAP 沉默，發(fā)現(xiàn)H1299 細(xì)胞同樣出現(xiàn)了凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能夠通過(guò)抑制TIRAP 的表達(dá)促進(jìn)肺癌H1299 細(xì)胞的凋亡。研究結(jié)果能夠?yàn)榉伟┑臐撛谥委熀涂拱╊?lèi)功能性食品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。