易亭伍，梁 睿，宿向東

(1.四川省樂山市人民醫(yī)院腫瘤血液科，四川 樂山 614000；2.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

鼻咽癌是我國(guó)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一[1]。同步放化療明顯改善了鼻咽癌患者的局部控制率及生存[2]。但晚期或局部晚期鼻咽癌在經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)治療后仍常出現(xiàn)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所以，研究鼻咽癌增殖轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為治療鼻咽癌尋找新的藥物靶點(diǎn)尤為重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用[3]。lncRNA主要通過調(diào)控相關(guān)的microRNA(miRNA)來影響下游基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖及分化。長(zhǎng)鏈非編碼核仁小RNA宿主基因15(Small nucleolar RNA host gene 15，SNHG15)在肝細(xì)胞肝癌[4]、結(jié)腸癌[5]等多種惡性腫瘤中扮演著促癌的作用，但其在鼻咽癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚無相關(guān)報(bào)道。本研究探究SNHG15在鼻咽癌中的表達(dá)，并分析其下游miRNA調(diào)控通路，希望為研究鼻咽癌分子生物學(xué)行為及潛在治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料 本研究共收錄50例鼻咽癌標(biāo)本及28例正常組織。所有組織均由四川大學(xué)華西醫(yī)院的病理科診斷。正常鼻咽上皮組織取自非鄰近腫瘤組織。所有受試者已簽署知情同意書。人鼻咽上皮細(xì)胞系NP69和4種鼻咽癌細(xì)胞系，CNE1、CNE2、SUNE1、HONE1均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。所有細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將CNE1和SUNE1細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中達(dá)到60%～70%的密度。將si-SNHG15(上海Genepharma公司，C-01-1804121)、陰性對(duì)照序列(NC)分別由轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR：總RNA由Trizol試劑按照制造商說明書進(jìn)行分離。實(shí)時(shí)定量PCR采用SYBR green real-time PCR試劑盒(上海Genepharma公司，QPG-043)進(jìn)行分析。所有結(jié)果均采用2-ΔΔCt計(jì)算。GAPDH和U6被用于內(nèi)參對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列如下：①SNHG15上游引物正向：5’-GCTGAGGTGACGGTCTCAAA-3’；下游引物反向：5’-GCCTCCCAGTTTCATGGACA-3’。②miR-141-3p上游引物正向：5’-CCTCGTCTTGAGCTGAGAGC-3’；下游引物反向：5’-AGGGCTCCCTGAAGGTTACT-3’。③Krüppel樣因子9(Krüppel-like factor 9，KLF9)上游引物正向：5’-GCCGCCTACATGGACTTCG-3’；下游引物反向：5’-GGATGGGTCGGTACTTGTTCA-3’。④U6上游引物正向：5’-GCTGAGGTGACGGTCTCAAA-3’；下游引物反向：5’-GCCTCCCAGTTTCATGGACA-3’ 。⑤GAPDH上游引物正向：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’；下游引物反向：5’- AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。

1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種于96孔板中，在指定時(shí)間點(diǎn)將10 μl CCK-8試劑添加到每個(gè)孔中，通過MRXII微孔板讀數(shù)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)：將SUNE1和CNE1細(xì)胞用6孔板培養(yǎng)2周后，用FBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次。用4%多聚甲醛將細(xì)胞固定，0.05%結(jié)晶紫在室溫下染色15 min，記錄細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的細(xì)胞克隆。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：收集經(jīng)SNHG15 siRNA和對(duì)應(yīng)的陰性參照轉(zhuǎn)染的CNE1或SUNE1細(xì)胞，碘化丙啶(PI)染色后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)：將藥物處理后的細(xì)胞用PBS(4 ℃)洗滌2 遍，棄去PBS 后加入細(xì)胞質(zhì)裂解液(RLA)，冰上孵育20 min，3000 r/min 離心15 min，所得上清液為胞質(zhì)蛋白。用RLA 洗滌沉淀，反復(fù)3 次后加入核裂解液(RIPA)，冰上孵育20 min，每隔5 min 渦旋振蕩30 s，12500 r/min 離心15 min，上清液為核蛋白。

1.2.7 雙熒光素酶檢測(cè)：利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-141-3p和SNHG15或KLF9的結(jié)合位點(diǎn)。含有miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)的SNHG15或KLF9的熒光素酶質(zhì)粒均由上海GenePharma合成(E-S-1-190121)。腫瘤細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型/突變型SNHG15或KLF9質(zhì)粒、miR-141-3p模擬物(mimics)/陰性對(duì)照(NC)質(zhì)粒后，通過標(biāo)準(zhǔn)化方法測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后相對(duì)熒光度值。

1.2.8 Western blot檢測(cè)：取上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用緩沖液NP-4裂解。用配制好的SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA將濾過膜封閉，然后將膜對(duì)應(yīng)的一抗在4 ℃下孵育1 h，接著將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL類試劑檢測(cè)蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。lncRNA與miRNA潛在關(guān)聯(lián)通過Starbase進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 SNHG15在鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá) 見圖1。與正常組織相比，SNHG15在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著增高(P<0.001)。Ⅲ-Ⅳ期鼻咽癌患者腫瘤組織中的SNHG15的相對(duì)表達(dá)量高于低分期組(P<0.01)。此外，Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，高表達(dá)的SNHG15預(yù)示著鼻咽癌患者的不良預(yù)后。與人正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69相比，SNHG15在4種鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)也顯著增高(P<0.01)。

2.2 低表達(dá)SNHG15抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖 見圖2。我們選擇SUNE1和CNE1細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。通過在SUNE1和CNE1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SNHG15 siRNA敲低細(xì)胞中SNHG15的表達(dá)，并通過qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01)。CCK8實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制SNHG15表達(dá)能夠顯著抑制SUNE1和CNE1細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了SNHG15 siRNA的SUNE1和CNE1細(xì)胞凋亡比例明顯增高(P<0.01)。2.3 SNHG15吸附并促進(jìn)miR-141-3p表達(dá) 見圖3。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SNHG15大多數(shù)分布于SUNE1和CNE1細(xì)胞的胞質(zhì)中。我們通過starbase分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p與SNHG15具有可能的結(jié)合位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)構(gòu)建了SNHG15野生型過表達(dá)質(zhì)粒(SNHG15-WT)及SNHG15突變型過表達(dá)質(zhì)粒(SNHG15-MUT)。通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p mimics有效降低了SNHG15 WT組的熒光素酶活性，而SNHG15 MUT組則未見明顯的改變。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p在鼻咽癌組織的表達(dá)明顯低于鼻咽正常組織，并且鼻咽癌組織中SNHG15的相對(duì)表達(dá)量與miR-141-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在SUNE1和CNE1轉(zhuǎn)染si-NC及si-SNHG15后通過qRT-PCR檢測(cè)miR-141-3p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示si-SNHG15能夠顯著促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中miR-141-3p的表達(dá)。

注：A圖中，與正常組織相比，***P<0.001；B圖中，與Ⅰ-Ⅱ期鼻咽癌患者相比，**P<0.01；D圖中，與NP69相比，**P<0.01

注：A、C、D圖中，與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01；B圖中，與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 miR-141-3p靶向抑制KLF9 見圖4。我們通過Target Scan預(yù)測(cè)了miR-141-3p可能結(jié)合的結(jié)合分?jǐn)?shù)較高的基因，通過功能分析選擇了KLF9進(jìn)行后續(xù)研究。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p能夠靶向結(jié)合KLF9。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，KLF9在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯增高。在SUNE1和CNE1轉(zhuǎn)染miR-141-3p NC及miR-141-3p mimics后通過qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KLF9的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-141-3p能夠顯著抑制KLF9 mRNA及蛋白的表達(dá)。

注：C圖中，與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01，***P<0.001；D圖中，與正常組織相比，***P<0.001；F圖中，與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01，***P<0.001

注：B圖中，與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01，***P<0.001；C圖中，與正常組織相比，**P<0.001；D圖中，與陰性對(duì)照組相比，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

鼻咽癌是我國(guó)常見的頭頸部惡性腫瘤之一，同步放化療作為標(biāo)準(zhǔn)治療手段取得了令人滿意的療效[6-7]。然而，仍然有近30%的患者在經(jīng)過放化療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗[8]。因此，探究鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制并尋找鼻咽癌治療新靶點(diǎn)很有必要。研究[9]發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤新生血管形成等多種機(jī)制參與鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移，其中l(wèi)ncRNA SNHG家族被發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切。lncRNA SNHG15是目前SNHG家族研究的熱點(diǎn)，被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的惡性增殖及分化相關(guān)[10]。但較少有研究探究SNHG15在鼻咽癌中的表達(dá)情況及調(diào)控機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)SNHG15在鼻咽癌中的表達(dá)顯著增高，同時(shí)高表達(dá)的SNHG15也預(yù)示著鼻咽癌患者的不良預(yù)后。在鼻咽癌細(xì)胞SUNE1和CNE1中抑制SNHG15后細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，同時(shí)細(xì)胞凋亡比例顯著增高，提示SNHG15可能參與了鼻咽癌細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移。

lncRNA的亞細(xì)胞定位決定著它們可能的生物學(xué)效應(yīng)。我們通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNHG15大多數(shù)分布于SUNE1和CNE1細(xì)胞的胞質(zhì)中，顯示SNHG15可能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。研究[11]發(fā)現(xiàn)，lncRNA常通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并抑制microRNA而影響microRNA下游基因的表達(dá)調(diào)控而發(fā)揮作用。microRNA表達(dá)水平失調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)[12]。蘇建淳等[13]發(fā)現(xiàn)，microRNA miR-124與鼻咽癌的增殖、侵襲及預(yù)后有顯著相關(guān)性。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中SNHG15的表達(dá)與miR-141-3p的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而干擾SNHG15后能夠顯著促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中miR-141-3p的表達(dá)，提示SNHG15能夠結(jié)合miR-141-3p并抑制其表達(dá)，SNHG15可能是通過抑制miR-141-3p而發(fā)揮作用的。

為了進(jìn)一步探究miR-141-3p下游靶點(diǎn)，我們通過TargetScan選擇了KLF9進(jìn)行后續(xù)研究。KLF9是一種與分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與神經(jīng)發(fā)育、B細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，KLF9是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，可能通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p能夠靶向結(jié)合KLF9，在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-141-3p能抑制KLF9 mRNA及蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明SNHG15可能結(jié)合并抑制miR-141-3p的表達(dá)，從而促進(jìn)miR-141-3p下游靶點(diǎn)KLF9的表達(dá)，參與鼻咽癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，SNHG15在鼻咽癌中異常高表達(dá)，可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-141-3p并影響其下游靶基因KLF9的表達(dá)，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖。