朱美霖，白宏英

(1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)寧 272000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

腦缺血性疾病是一種高發(fā)性、高致死率的嚴(yán)重影響人類健康的一種疾病。近年來我國腦缺血性疾病的致死率位居首位[1]。腦缺血再灌注損傷一直是研究的熱點，腦缺血再灌注機制包括炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣超載、能量障礙等多種因素。腦缺血時可激活凋亡蛋白的表達(dá)，引起腦細(xì)胞的凋亡，盡早進(jìn)行抗細(xì)胞凋亡治療是減少神經(jīng)損傷的重要一環(huán)。在細(xì)胞凋亡過程中B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BCL2-Associated X)與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，其中Bcl-2對腦細(xì)胞凋亡起到抑制作用，而Bax對細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用[2]。Purmorphamine(PM)是一種無毒性小分子的嘌呤衍生物，可以激活Sonic Hedgehog信號通路。有研究表明PM可以透過血腦屏障，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮抗炎作用，而在蛛網(wǎng)膜下腔出血中具有神經(jīng)保護(hù)作用[3]。目前對于PM對腦缺血再灌注大鼠模型細(xì)胞凋亡的影響研究甚少，因此本次研究就此問題進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組：選取健康成年雄性SD大鼠75只，體重約220～250 g。將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組五組，各組15只大鼠。PM低劑量組于術(shù)后給于5 mg/kg腹腔注射Purmorphamin溶液，PM中劑量組于術(shù)后給予10 mg/kg腹腔注射Purmorphamine溶液，PM高劑量組給予20 mg/kg腹腔注射Purmorphamin溶液。模型組及假手術(shù)組給予DMSO溶液腹腔注射。

1.1.2 材料：Purmorphamine粉劑購于上海凱試公司，DMSO購自美國Sigma公司，D-140圖像記錄分析系統(tǒng)(大連競邁儀器有限公司)、微型離心機(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)、抗Bcl-2抗體Santacruz、Sc23960GAPDH抗體、ABCAMAb8245抗Bax抗體Santacruz、ECL試劑盒購于北京中山、0412-31二抗(Zymed公司)、SK-30高速冷凍離心機購于美國SIGMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備及給藥：采用Longa等[4]改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型。大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮消毒后切開頸部皮膚，鈍性分離周圍組織，暴露并分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈及頸總動脈。在距離頸總動脈分叉處0.4 cm處剪出小口，插入制備好的線栓，松開動脈夾，使線栓進(jìn)入顱內(nèi)，插入深度約17～19 cm保證大腦中動脈血流被阻斷。固定線栓，2 min后拔出線栓縫合皮膚。假手術(shù)組僅分離頸總動脈及分支，并不給予其余處理。PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組分別按既定的5、10、20 mg/kg的劑量給予腹腔注射配備好的Purmorphamine溶液，假手術(shù)組及模型組給予同等劑量的DMSO溶液腹腔注射。術(shù)后大鼠保溫蘇醒后單籠飼養(yǎng)，室溫保持在20～30 ℃。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分：大鼠清醒后采用Longa[4]5分制作為評分標(biāo)準(zhǔn)。0分：完全無神經(jīng)缺損癥狀。1分：輕度運動障礙，右前爪曲屈狀態(tài)。2分：中度運動障礙，行走時右轉(zhuǎn)彎。3分：行走向右傾倒無法保持平衡。4分：出現(xiàn)意識障礙。其中1～3分視為造模成功納入實驗分組。

1.2.3 TTC測大腦梗死面積：各組大鼠隨機選取5只麻醉后斷頭取出腦組織，將腦組織放在-20 ℃冰箱內(nèi)冰凍20 min。取出腦組織沿冠狀面切成約2 mm的切片，并將切片放置于2% TTC的PBS緩沖液中于37 ℃避光培養(yǎng)30 min，取出切片4%甲醛溶液固定，腦梗死組呈紅色，正常腦組織呈白色，采用圖像分析系統(tǒng)測定梗死腦組織面積，并計算腦梗死體積比值。

1.2.4 采用原位TUNEL方法檢測腦缺血區(qū)細(xì)胞凋亡情況：根據(jù)TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水合，蛋白酶K溶液去除組織蛋白，PBS漂洗后樣本中加入TUNEL反應(yīng)液50 μl，37 ℃下反應(yīng)50 min，PBS漂洗后加入DAB顯色液50 μl，隨后蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。光鏡下隨機選取五個視野觀察凋亡細(xì)胞素，其中細(xì)胞核呈濃縮棕黃色顆粒為凋亡陽性細(xì)胞，多見于梗死腦組織周圍，取平均值計算陽性細(xì)胞數(shù)。凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.5 Western blot 分析Bcl、Bax的表達(dá)：組織剪切成小塊，加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解。14000 g離心5 min，取上清。5%濃縮、10%分離膠溶液的制備和灌注、將樣品稀釋到相同的濃度，體積為20 μl，加入4 μl上樣緩沖液，混勻后在沸水浴中煮沸5 min。泳道中加入8 μl蛋白質(zhì)Marker，在其余泳道中把樣品全部加入到泳道中。穩(wěn)壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到濃縮膠與分離膠的界面時，調(diào)整電壓到100 V，穩(wěn)壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移到分離膠下緣時，停止電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉。將一抗按1∶1000稀釋，4 ℃搖床低速搖動過夜孵育。洗脫緩沖液洗滌3次，時間分別為15、10、5 min。第二抗體為羊抗兔，按1∶4000稀釋，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，低速搖動孵育45 min。洗脫緩沖液洗滌3次，每次5 min。在暗室中，滴加1×顯影液和定影液分別倒入瓷盤中，定影5～10 min，至膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液，室溫晾干。拍照備用。膠片掃描后用Bandscan 5.0軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)缺損評估及腦梗死體積比較 模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與假手術(shù)組相比較明顯升高，梗死體積比明顯增大(P<0.05)。藥物組(PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組)與模型組相比較神經(jīng)功能缺損評分明顯降低，腦梗死體積比明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評估及腦梗死體積比較

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 模型組大鼠腦細(xì)胞凋亡率與假手術(shù)組相比較明顯升高(P<0.01)，藥物組腦細(xì)胞凋亡率與模型組凋亡率明顯下降，其中PM高劑量組凋亡率下降最為顯著(P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.3 各組Western blot檢測Bcl-2、Bax的表達(dá) 假手術(shù)組可見極少量蛋白表達(dá)。模型組與假手術(shù)組相比較，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥組與模型組相比較，Bcl-2表達(dá)明顯增多，其中PM高劑量組的增多最為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Bax蛋白表達(dá)在假手術(shù)組中少見，模型組與假手術(shù)組相比較Bax蛋白表達(dá)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組較模型組相比較Bax的表達(dá)明顯下降，其中PM高劑量組Bax表達(dá)下降最為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組Bcl-2、Bax的表達(dá)

圖1 Western Blot檢測Bcl-2、Bax的表達(dá)

3 討 論

腦缺血再灌注是一個涉及到鈣超載、炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡、自由基損傷等一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞凋亡是其中一個極其重要的病理生理機制[5-6]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化、自主化死亡的復(fù)雜過程，該過程由多種調(diào)節(jié)基因共同調(diào)控完成。某些生理或病理因素誘導(dǎo)下激活膜信號系統(tǒng)，啟動有關(guān)調(diào)控細(xì)胞凋亡的程序基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞按一定程度控制自我破壞和死亡[7]。在眾多調(diào)控基因中Bcl家族基因家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。Bcl-2蛋白和Bax蛋白是目前Bcl家族中研究比較廣泛深入的基因。促凋基因Bax和抑凋基因Bcl-2家族具有同源性[8]，Bcl-2 蛋白和Bax蛋白是線粒體外膜上一對相互拮抗的細(xì)胞凋亡因子，有研究表明Bcl-2蛋白和Bax蛋白是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的最重要基因[9-10]。Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，可以通過抑制Bax蛋白的轉(zhuǎn)位，保護(hù)線粒體電勢梯度，調(diào)節(jié)鈣離子的自穩(wěn)狀態(tài)，抑制氧自由基的產(chǎn)生，從而抑制凋亡途徑[11]。因此Bcl-2蛋白常作為對細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究的觀察指標(biāo)。Bax蛋白是一種促凋亡蛋白，不但起到拮抗Bax蛋白的作用，而且有直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl蛋白和Bax蛋白之間的平衡影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此本次研究選取Bcl蛋白和Bax蛋白作為觀察細(xì)胞凋亡的指標(biāo)，以探究 Purmorphamine在對腦缺血再灌注細(xì)胞凋亡的影響。

Purmorphamine是一種分子量為520.62的小分子嘌呤衍生物，可與SHH信號通路中SMO蛋白結(jié)合從而激活SHH信號通路[ 12]。Purmorphamine與腦缺血性疾病關(guān)系密切[13]。Purmorphamine可以激活SHH信號通路促進(jìn)腦缺血大鼠的血管再生，也可促進(jìn)腦缺血神經(jīng)元修復(fù)。Chechneva[14]研究表明Purmorphamine在腦缺血中可使血腦屏障通透性下降以及受損神經(jīng)元組織型纖溶酶原激活物短暫上調(diào)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，Purmorphamine可以提高海馬神經(jīng)元抵抗能力，通過抗氧化來保護(hù)海馬神經(jīng)元，從而減少神經(jīng)元死亡[15]。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)Purmorphamine可以減輕腦缺血再灌注后的腦梗死面積，同時可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

本研究顯示在大鼠腦缺血再灌注模型組6 h后Bax較假手術(shù)組明顯上調(diào)，而Bcl-2較假手術(shù)組明顯下降，這提示Bax和Bcl-2參與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的調(diào)控，這與之前研究相符合。而PM組與模型組相比較，Bax的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2的表達(dá)明顯上調(diào)，這表明Purmorphamine可以通過抑制Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血后腦損傷。PM高劑量組與其他劑量組相比較，對Bax的表達(dá)下調(diào)及Bcl-2表達(dá)上調(diào)的作用更為顯著。這表明Purmorphamine對細(xì)胞凋亡的影響與劑量呈正相關(guān)。本研究仍有大量不足。對于Purmorphamine調(diào)控Bax和Bcl-的表達(dá)的具體機制，是否與SHH信號通路被激活有關(guān)等相關(guān)問題仍需進(jìn)一步深入研究。