張靖芳， 鄭 霄， 臧柳園， 鄭冬云*,2,3

(1.中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢 430074;2.醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074;3.腦認(rèn)知科學(xué)實(shí)驗(yàn)室國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

同型半胱氨酸(2-氨基-4-巰基丁酸)是生物體內(nèi)一種低分子量氨基硫醇，為人體必需的氨基酸，它不能通過食物攝入獲得，而是蛋氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物。生物體內(nèi)，同型半胱氨酸以二硫鍵的形式與半胱氨酸、還原型谷胱甘肽以及蛋白質(zhì)交聯(lián)。生物樣品中同型半胱氨酸的總濃度指的是上述所有種類同型半胱氨酸濃度的總和，人體血漿內(nèi)同型半胱氨酸總濃度的正常值通常在5.0～16.0 μmol/L之間[1]。而維生素B12、葉酸和磷酸吡哆醛的缺乏[2]，遺傳因素，甲烯四氫葉酸還原酶[3](MTHFR)等的基因多態(tài)性，這些因素可造成同型半胱氨酸濃度升高，從而引發(fā)高同型半胱氨酸血癥。研究證明，該疾病與老年認(rèn)知障礙、缺血性心腦血管疾病、肺栓塞、外周血管疾病[4]、腫瘤、妊娠期胎兒不良、高血壓[5]以及糖尿痛腎臟病變[6]等疾病的發(fā)生都有著密切的關(guān)系。因此，對同型半胱氨酸的快速、高靈敏、準(zhǔn)確檢測將可以為臨床上相關(guān)疾病的診斷提供重要的輔助信息。目前已見報(bào)道的同型半胱氨酸檢測方法包括以下幾種：高效液相色譜(HPLC)[7]法、毛細(xì)管電泳(CE)法[8]、氣相色譜法(GC)[9]、熒光光譜[10]法、免疫分析[11]法、分子印跡熒光傳感[12]法以及電化學(xué)傳感法。其中，電化學(xué)傳感法因具有操作簡單、成本低、靈敏度高、響應(yīng)快速、易于微型化和自動(dòng)化等特點(diǎn)而備受關(guān)注。因此，本研究擬采用電化學(xué)傳感法，以實(shí)現(xiàn)對同型半胱氨酸的高靈敏、快速、準(zhǔn)確的檢測。

石墨烯是一種典型的二維碳納米材料，具有獨(dú)特的sp2雜化晶體結(jié)構(gòu)和蜂窩結(jié)構(gòu)，因分子中存在離域π鍵而擁有的大量離域電子，使其具有非凡的電子特性和電學(xué)性質(zhì)。目前已被報(bào)道用于NO[13]、葡萄糖[14]、DNA[15]、抗壞血酸[16]、多巴胺[17]、蛋白質(zhì)[18]以及L-半胱氨酸[19]等生物分子的電化學(xué)與生物傳感檢測。金納米粒子由于其獨(dú)特的化學(xué)、電子學(xué)和光學(xué)性能以及良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)傳感、腫瘤治療、生物標(biāo)記、重金屬分析、化工催化等[20]領(lǐng)域。本文基于金納米粒子-石墨烯復(fù)合膜構(gòu)建了同型半胱氨酸電化學(xué)傳感界面。一方面，借助于金納米粒子和石墨烯作為納米材料的大比表面積，增大修飾電極的有效面積，增加同型半胱氨酸在化學(xué)修飾電極表面的富集量，提高傳感器的檢測靈敏度；另一方面，金納米粒子和石墨烯良好的導(dǎo)電性可促進(jìn)同型半胱氨酸與化學(xué)修飾電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率，從而縮短傳感器的響應(yīng)時(shí)間；此外，金與同型半胱氨酸結(jié)構(gòu)中的巰基有良好的親和作用，可在一定程度上保證傳感器的選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；pHS-3E酸度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；掃描電鏡(SEM)及能量色散X射線(EDX)光譜表征在FEI-Sirion 200場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI公司)上進(jìn)行。

氧化石墨烯粉末(粒徑1～10 μm，濟(jì)寧利特納米技術(shù)責(zé)任有限公司)，液體石蠟(化學(xué)純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)，D，L-高半胱氨酸(又稱同型半胱氨酸，HcySH，純度>90%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，HAuCl4·4H2O(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：稱取50 g NaCl，1.25 g KCl，22.375 g Na2HPO4·12H2O，1.5 g KH2PO4溶于200 mL的超純水，調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，定容至250 mL。實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

AB膠及銅絲購于本地五金建材超市。

1.2 石墨烯碳糊電極的制備

圖1 石墨烯碳糊電極示意圖Fig.1 Schemetic diagram of carbon paste electrode

石墨烯碳糊電極的制備：(1)將直徑為500 μm的銅絲穿入尖端直徑為200 μm的塑料管內(nèi)，并用AB膠將銅絲和槍頭尾端固定；(2)稱取10 mg石墨烯粉末，并置于瑪瑙研缽中與30 μL石蠟油混合，充分研磨制得石墨烯碳糊；(3)將石墨烯碳糊擠壓進(jìn)槍頭尖端，并在稱量紙上磨平，即制得石墨烯碳糊電極。如圖1所示。

在使用之前，將所制得的石墨烯碳糊電極置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]及1 mol/L KCl溶液中，在-0.2～0.8 V電位范圍內(nèi)，以100 mV/s的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以檢查電極是否漏液，并確保所制備的石墨烯碳糊電極具有良好的重現(xiàn)性。

石墨烯碳糊電極的更新：將電極頭端部分在無水乙醇中超聲2 min，待電極頭端空腔被清洗干凈后，空氣中晾干，重新填充新石墨烯碳糊。

1.3 金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極的制備

將檢驗(yàn)合格的石墨烯碳糊電極置于5.0 mmol/L HAuCl4溶液中，在-1.5～0 V電位范圍內(nèi)[21]，以100 mV/s的掃描速率循環(huán)伏安掃描10圈，即制得金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極。

1.4 同型半胱氨酸的電化學(xué)檢測

檢測均采用三電極系統(tǒng)。其中，裸石墨烯碳糊電極或金納米粒子-石墨烯碳糊電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑電極為對電極。檢測底液為0.25 mol/L的PBS(pH=7.0)，掃描電位范圍為-0.2 V～0.8 V，富集電位為-0.2 V，富集時(shí)間為40 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電極的表面形貌表征及能譜分析

為探究金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極對同型半胱氨酸的電催化機(jī)理，借助于掃描電子顯微鏡技術(shù)對不同電極的表面形貌進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2所示。裸石墨烯碳糊電極的表面較平整(圖2A)；電沉積金納米粒子之后，電極表面變得較疏松，且可以觀察到大量金納米顆粒(圖2B)。不管是電極表面的疏松結(jié)構(gòu)，還是石墨烯和金納米顆粒的納米效應(yīng)，都有利于增大電極的比表面積，提高傳感器對同型半胱氨酸的有效富集，為傳感器的高靈敏度提供良好基礎(chǔ)。此外，金與同型半胱氨酸結(jié)構(gòu)中的巰基具有良好的親和作用，這一點(diǎn)可有效保證傳感器對同型半胱氨酸檢測的特異性。

圖2 裸石墨烯碳糊電極(A)以及金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極(B)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of bare graphene carbon paste electrode(A) and Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode(B)

圖3 裸石墨烯碳糊電極(A)和金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極(B)的能量色散X射線(EDX)光譜表征圖Fig.3 EDX sepctra of bare graphene carbon paste electrode(A) and Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode(B)

2.2 金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極的循環(huán)伏安特性

以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]為分子探針，考察了不同電極的電化學(xué)性能，結(jié)果如圖4所示。在裸石墨烯碳糊電極上，出現(xiàn)了一對峰形較好的氧化還原峰，其中氧化峰的峰電位為Epa=0.30 V，峰電流為Ipa=1.4 μA；還原峰的峰電位為Epc=0.20 V，峰電流為Ipc=1.5 μA。在金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極上，同樣可以觀察到一對峰形較好的氧化還原峰，其中氧化峰的峰電位為Epa=0.27 V，峰電流為Ipa=3.3 μA；還原峰的峰電位為Epc=0.19 V，峰電流為Ipc=3.2 μA。顯然，金納米粒子的修飾使分子探針的電化學(xué)響應(yīng)得到了顯著改善。這可能是由于金納米粒子的修飾改變了電極的表面結(jié)構(gòu)，有效增大了電極的比表面積，這與掃描電鏡表征的結(jié)果相一致。

2.3 同型半胱氨酸在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)

對同型半胱氨酸在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖5所示。在裸石墨烯碳糊電極上，當(dāng)?shù)滓褐袥]有同型半胱氨酸時(shí)，觀察不到電化學(xué)響應(yīng)(曲線d)；當(dāng)?shù)滓褐泻型桶腚装彼釙r(shí)，僅在0.14 V觀察到一個(gè)微弱的氧化峰，峰電流為0.052 μA(曲線c)。在金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極上，當(dāng)?shù)滓褐形刺砑油桶腚装彼釙r(shí)，可在0.42 V左右觀察到一個(gè)峰形較寬的氧化峰，峰電流為0.18 μA，對應(yīng)于金納米粒子的氧化；向底液中加入同型半胱氨酸后，則在0.46 V出現(xiàn)了一個(gè)峰形尖銳的氧化峰，峰電流為：0.79 μA。顯然，金納米粒子的修飾使同型半胱氨酸的氧化峰電流從0.052 μA增大至0.79 μA，增大了14.2倍，說明金納米粒子對同型半胱氨酸具有良好的富集效應(yīng)和電催化作用。

圖4 裸石墨烯碳糊電極(實(shí)線)以及金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極(虛線)在5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 和1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖(掃描速率：100 mV/s)Fig.4 Cyclic voltammograms of bare graphene carbon paste electrode(solid line) and Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode(dash line) in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] and 1 mol/L KCl solution(scan rate:100 mV/s)

2.4 掃描速率對同型半胱氨酸電化學(xué)響應(yīng)的影響

為探究同型半胱氨酸在金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極上的電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理，采用線性掃描伏安法，考察了掃描速率對同型半胱氨酸伏安響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6A所示。在50～300 mV/s的掃描速率范圍內(nèi)，氧化峰電流隨掃描速率的增大而線性增加，Ip(μA)=9.7×10-4v+0.065(R=0.94)(圖6B)，表明同型半胱氨酸在金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極上的電化學(xué)氧化反應(yīng)是一個(gè)受吸附控制的過程。同時(shí)，同型半胱氨酸在傳感器上的電化學(xué)氧化又是一個(gè)完全不可逆的過程，根據(jù)Laviron理論[22]，對于受吸附控制的完全不可逆的電化學(xué)反應(yīng)過程，峰電位與掃描速度的自然對數(shù)成線性關(guān)系，關(guān)系式如下：

(1)

式中：E0′是形式電位，α是電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，k0是標(biāo)準(zhǔn)速率常數(shù)，n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)。

對于完全不可逆的受吸附控制的過程，α一般取0.5。本體系中，峰電位與掃描速度的自然對數(shù)之間的關(guān)系為：Ep(V)=0.1+0.065lnv(mV/s),R=0.98(圖6C)。根據(jù)公式(1)，我們可以計(jì)算出n=0.8≈1，即：同型半胱氨酸在傳感器上的電化學(xué)氧化過程是一個(gè)一電子參與過程。

2.5 底液pH值對同型半胱氨酸電化學(xué)響應(yīng)的影響

對底液pH值的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖7A所示。當(dāng)?shù)滓簆H值從5.0逐漸升高至9.0時(shí)，同型半胱氨酸的氧化峰電流先是逐漸增大，在pH=7.0時(shí)達(dá)到最大，之后又逐漸減小(圖7B)。這可能是由于當(dāng)?shù)滓簆H值為7.0時(shí)，修飾電極對同型半胱氨酸具有較好的富集效應(yīng)。因此，本體系選擇7.0為檢測底液的最佳pH值。此外，隨著底液pH值的升高，同型半胱氨酸的氧化峰電位逐漸負(fù)移，且與pH值呈線性關(guān)系：Ep=0.77-0.051pH(R=0.93)。由Ep-pH關(guān)系曲線的斜率-0.059(m/n)pH(m為反應(yīng)中轉(zhuǎn)移的質(zhì)子數(shù)，n為轉(zhuǎn)移的電子數(shù)，在本體系中n≈1)，可計(jì)算出：m≈1。故同型半胱氨酸在傳感界面上的反應(yīng)是一個(gè)一電子一質(zhì)子參與的電化學(xué)過程。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[23,24]，推測同型半胱氨酸在傳感器上的電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理如下：

2.6 傳感器性能評價(jià)

2.6.1 線性范圍、靈敏度、檢出限和響應(yīng)時(shí)間采用安培響應(yīng)法對傳感器的部分性能進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果如圖8所示。經(jīng)數(shù)據(jù)分析可知，當(dāng)同型半胱氨酸的濃度在3.0～100 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，其氧化峰電流與其濃度呈良好的線性關(guān)系：Ip(nA)=2.29+1.22c(μmol/L),R=0.99(圖8內(nèi)插圖)；方法靈敏度為1.22 nA/(μmol/L);檢出限為0.8 μmol/L；響應(yīng)時(shí)間為3 s。

圖8 不同濃度HcySH在金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極上的安培響應(yīng)圖(內(nèi)插圖為HcySH的氧化峰電流與其濃度之間的線性關(guān)系圖)Fig.8 Amperometric response of different concentrations of HcySH at Au nanoparticles modified graphene carbon paste electrode in 0.25 mol/L PBS(pH=7.0) with the operation potential of 0.4 V(Inset:The linear relationship between the oxidation peak current of HcySH and its concentration)

2.6.2 抗干擾能力、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性借助安培響應(yīng)法，對傳感器的抗干擾能力進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果顯示10倍的Cl-,5倍的Na+、K+、Ca2+，1.3倍的Mg2+，0.1倍的抗壞血酸、尿酸對100 μmol/L同型半胱氨酸的測定不產(chǎn)生干擾(信號變化小于±5%)。說明該傳感器對無機(jī)離子的抗干擾能力較好，但對生物小分子的抗干擾能力有待進(jìn)一步提高。

此外，借助于線性掃描伏安法，對傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性進(jìn)行了考察。將傳感器放置7 d后再進(jìn)行平行測定，檢測信號依舊可以保持為初始信號的92%，說明傳感器具有較好的穩(wěn)定性。用同一支金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極對100 μmol/L HcySH平行測定8次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6%；用8支不同的金納米粒子修飾石墨烯碳糊電極對100 μmol/L HcySH進(jìn)行平行檢測，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，說明傳感器具有較好的重現(xiàn)性。

2.6.3 準(zhǔn)確性借助于安培響應(yīng)技術(shù)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，對傳感器檢測同型半胱氨酸的準(zhǔn)確性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，6次測定的回收率為91.0%～103.2%，平均回收率為97.2%，表明該傳感器具有一定的準(zhǔn)確性。但傳感器對生物小分子的抗干擾能力有限，因此目前還不太適用于生物樣品中同型半胱氨酸的測定。在今后的研究中，課題組會將提高傳感器的選擇性作為研究重點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)傳感器在生物樣品中的應(yīng)用。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the recovery experiment

3 結(jié)論

本工作將石墨烯直接用于碳糊電極的制備，省去了石墨烯的功能化及溶劑分散等步驟，在很大程度上簡化了操作流程；利用簡單可控的電沉積法將金納米粒子修飾到石墨烯碳糊電極表面，從而構(gòu)建了同型半胱氨酸電化學(xué)傳感界面。電化學(xué)技術(shù)表征表明，金納米粒子-石墨烯復(fù)合膜對同型半胱氨酸的電化學(xué)反應(yīng)具有明顯的催化作用；對納米復(fù)合膜進(jìn)行了掃描電鏡和能量色散X射線光譜表征，對同型半胱氨酸在傳感界面上的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了探討，并對傳感器的各項(xiàng)性能進(jìn)行了評價(jià)。傳感器基本性能良好，但對生物小分子的抗干擾能力有待進(jìn)一步提高，這在一定程度上限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，也是本工作后續(xù)研究的要點(diǎn)。