陳麗君，周彥妤，靳曉拓，宋 禹，吳春蕊，趙洪偉*

(1.海南省植物保護(hù)總站，海南 ?？?570100；2.海南省熱帶生態(tài)環(huán)境修復(fù)工程研究中心&海南省農(nóng)林環(huán)境過程與生態(tài)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南 ?？?570228)

多效唑(PBZ)是一種三唑類化合物，具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)兼廣譜殺菌作用[1]。多效唑通常通過噴施或者直接應(yīng)用于土壤中，會(huì)對(duì)作物的生長(zhǎng)和土壤微生物活性造成不同程度的影響[2-3]。細(xì)菌和真菌群落是土壤微生物中的重要功能群，它們可以通過不同方式來提高土壤養(yǎng)分利用效率[4]。細(xì)菌與真菌間的相互作用在土壤環(huán)境中十分重要[5]，細(xì)菌和真菌之間的協(xié)同作用不僅利于土壤中有機(jī)污染物的生物降解，而且能提高植物抵御環(huán)境脅迫的能力[6-7]。以往的研究強(qiáng)調(diào)了多效唑的過量使用會(huì)對(duì)土壤微生物有一定負(fù)面影響[8-9]，然而這些研究只關(guān)注于評(píng)估多效唑?qū)?xì)菌多樣性和群落組成變化等的影響，常忽視微生物間的相互作用分析。但微生物各類群之間有一定的關(guān)聯(lián)性，會(huì)形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。微生物網(wǎng)絡(luò)分析可以揭示微生物群落的復(fù)雜性和群落成員之間的相互關(guān)系[10]。本文研究了多效唑?qū)ν寥兰?xì)菌和真菌的影響，在此基礎(chǔ)上，采用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析方法，分析了在不同時(shí)間下不同濃度多效唑處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌相互作用網(wǎng)絡(luò)變化的影響，以評(píng)估其對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的不利影響，以期為合理使用多效唑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 95%多效唑原藥，二甲基亞砜，分析級(jí)乙腈，土壤DNA 提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒。本試驗(yàn)采用海南大學(xué)試驗(yàn)基地紅壤土。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)多效唑施用推薦用量(2～4mg/kg)和調(diào)研海南省三亞與樂東地區(qū)15個(gè)芒果園農(nóng)民實(shí)際用量(20～50mg/kg)，設(shè)置0、3和30mg/kg 3個(gè)處理濃度。施藥前先用DMSO配置濃度為3和0.3mg/mL的多效唑母液。采集土壤并過40目篩后稱取100g土壤于棕色小瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，取出20g土壤，D3處理組加入1.0mL 0.3mg/mL多效唑原藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，D30處理組加入1.0mL 3mg/mL多效唑原藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白組加入1.0mL的DMSO，立即混勻，隨后倒入剩余土壤[11]，反復(fù)混勻5min，使其對(duì)應(yīng)的土壤中施藥濃度為0、3、30mg/kg。稱取各瓶的重量并記錄，將土壤樣品置于25℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間用恒重法給各土樣補(bǔ)充蒸餾水以穩(wěn)定保持土壤含水量為50%。于施藥處理3d(T1)、10d(T2)、60d(T3)、150d(T4)的各采集2份土壤樣品，一份用于多效唑原藥殘留量的測(cè)定，一份用于提取DNA用于土壤真菌和細(xì)菌高通量測(cè)序分析。

1.2.2 樣品預(yù)處理 用天平稱取施藥處理3、10、60、150d的土樣3g，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，加入3mL蒸餾水、30mL乙腈，放入搖床室溫振蕩2～3h(rpm：230)，振蕩結(jié)束后靜置3h，隨后將上清液倒入比色管中，每份樣品加入1g左右氯化鈉，搖勻直至分層，取上層溶液15mL于棕色瓶進(jìn)行氮吹，氮吹結(jié)束后加入色譜乙腈1mL定容，過0.22μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 高效液相色譜分析 使用安捷倫1260高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)測(cè)定；C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈/水=55/45(V/V)；流速1.0mL/min；多效唑原藥檢測(cè)波長(zhǎng)：222nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10.0μL[12]。

1.2.4 DNA提取和測(cè)序分析 土壤DNA的提取采用試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation kit)；土壤細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物：515F(GTGCCAGCMGCCGCG-GTAA)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)，土壤真菌PCR擴(kuò)增引物：ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)'和引物ITS2R (GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)進(jìn)行[3，13]。樣品DNA的PCR質(zhì)量驗(yàn)證滿足要求后，委托北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌16s rRNA測(cè)序分析和真菌ITS測(cè)序分析，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq2500，使用百邁克云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究的統(tǒng)計(jì)分析均采用 SPSS v16.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用R語(yǔ)言的‘psych’數(shù)據(jù)包[14]Corr.test計(jì)算樣品相關(guān)性矩陣并執(zhí)行檢驗(yàn)不同菌群所有物種間的Pearson相關(guān)性系數(shù)，得到相關(guān)性系數(shù)矩陣和P值矩陣，確定物種間存在相互作用關(guān)系的閾值(ρ>0.8，P-Value<0.05)，利用Gephi 0.9.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)繪制和計(jì)算拓?fù)湫再|(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多效唑HPLC分析方法 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法依次測(cè)定了不同濃度多效唑原藥標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積。多效唑濃度與峰面積線性關(guān)系良好 (相關(guān)系數(shù)R≥0.999)，回歸方程為y = 253.85x-2.386 2，R2= 0.999 8，可滿足多效唑檢測(cè)分析要求以實(shí)現(xiàn)多效唑的定量分析。添加回收率試驗(yàn)表明，該方法添加多效唑0～3mg/kg(0、0.03、0.3、3mg/kg)，回收率在96.38%～108.72%之間，變異系數(shù)在2.27%～3.14%之間，滿足試驗(yàn)分析要求。

2.2 多效唑的降解 (表1)可知土壤中多效唑原藥的殘留量不斷減少，多效唑原藥的降解率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，在施藥處理150d表現(xiàn)出最高降解率。

表1 土壤多效唑原藥降解率

2.3 微生物群落組成 在門水平上，(圖1A)可知T1～T3時(shí)期相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌菌門中主要有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)等，T4時(shí)期主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌門是厚壁菌門(Firmicutes)，CK組(36.42%)、D3處理組(16.99%)、D30處理組(25.54%)。T1～T3時(shí)期，與CK組相比，D30處理組中綠彎菌門(Chloroflexi)相對(duì)豐度分別增加7.6%、6.7%、7.2%，而酸桿菌門(Acidobacteria)相對(duì)豐度分別降低1.5%、7.0%、5.9%。T4時(shí)期，與CK組相比，D3處理組綠彎菌門(Chloroflexi)豐度降低5.3%，D3和D30處理組放線菌門(Actinobacteria)相對(duì)豐度分別降低37.58%、43.71%，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對(duì)豐度分別增加6.58%、10.60%。T4時(shí)期，擬桿菌門(Bacteroidetes)在CK、D3、D30 處理組中占相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌菌門的11.59%、20.10%、29.60%，處理組相對(duì)豐度上升。(圖1C)可知相對(duì)豐度>1%的土壤真菌菌門有子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。與CK組相比，T1時(shí)期D3和D30處理組子囊菌門(Ascomycota)相對(duì)豐度分別增加9.63%、21.58%，T4時(shí)期分別降低33.80%、7.39%。T2時(shí)期D30處理組壺菌門(Chytridiomycota)較CK組相對(duì)豐度增加1.82倍，T4時(shí)期降低 68.74%。T4時(shí)期D3及D30處理組的擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對(duì)豐度分別比CK組降低55.54%和12.90%。

在屬水平上，(圖1B)可知，相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌菌屬為假諾卡氏菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、諾卡菌屬(Nocardioides)等，T1時(shí)期，CK、D3、D30 處理組中的假諾卡氏菌屬(Sphingomonas)，占相對(duì)豐度>1%的細(xì)菌菌屬的11.00%、10.87%、10.80%，T4時(shí)期僅占5.79%、6.06%、5.30%。(圖1D)可知相對(duì)豐度>1%的真菌菌屬有Spizellomyces屬、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillus)等。T4時(shí)期，CK、D3、D30處理組中未分類菌屬和其他菌屬分別占相對(duì)豐度>1%的真菌菌屬的86.04%、91.08%、92.84%。T4時(shí)期，曲霉屬(Aspergillus)相對(duì)豐度分別為2.68%、0.78%、154%，鐮刀菌屬(Fusarium)相對(duì)豐度分別為5.80%、4.27%、2.76%，多效唑處理組曲霉屬、鐮刀菌屬相對(duì)豐度均下降。在T3時(shí)期中，CK組的Spizellomyces屬相對(duì)豐度為16.60%，D3處理組(13.68%)和D30處理組(15.42%)的相對(duì)豐度均低于CK組。多效唑處理組細(xì)菌和真菌群落物種相對(duì)豐度與CK組相比，發(fā)生明顯變化，表明多效唑處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落的物種組成有一定影響。

2.4 α多樣性和β多樣性分析 α多樣性是反映細(xì)菌和真菌群落多樣性和豐富度的綜合指標(biāo)，比較樣品的α多樣性指數(shù)，(表2)和(表3)可知，T2時(shí)期D3處理和D30處理組Simpson指數(shù)相較于CK組分別顯著降低了38.05%和24.77%，說明多效唑處理在一定程度上促進(jìn)土壤細(xì)菌多樣性增加。T4時(shí)期，與CK組相比，D3處理組土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著下降9.14%，表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度多效唑處理降低土壤細(xì)菌菌群多樣性。不同濃度多效唑處理對(duì)土壤真菌的多樣性影響不同，T2時(shí)期真菌菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)沒有顯著區(qū)別，T4時(shí)期D3處理組土壤真菌Shannon指數(shù)顯著增加22.75%，表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度多效唑處理促進(jìn)土壤真菌菌群多樣性增加。

表2 細(xì)菌α多樣性指數(shù)

表3 真菌α多樣性指數(shù)

T2時(shí)期，與CK組相比，D3和D30處理組土壤細(xì)菌ACE指數(shù)分別顯著降低1.06%和0.52%，土壤真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)無(wú)顯著區(qū)別。T4時(shí)期，與CK組相比，土壤細(xì)菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)無(wú)顯著區(qū)別，土壤真菌菌群D3處理組ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)相較于CK組分別增加了33.19%和43.54%，D30處理組ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)相較于CK組分別顯著增加了58.24%和73.50%，處理后期土壤真菌豐富度表現(xiàn)出增高趨勢(shì)。

對(duì)細(xì)菌和真菌β多樣性進(jìn)行分析。土壤細(xì)菌的PCoA分析結(jié)果(圖2A)所示，T1至T3時(shí)期，各處理組與CK組距離不大，群落結(jié)構(gòu)相似性高，T4時(shí)期處理組和CK組距離較遠(yuǎn)。說明處理前期，多效唑?qū)?xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不大，T4時(shí)期多效唑改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)D30處理組和CK組在主成分2軸區(qū)分，說明隨處理時(shí)間增加，高濃度多效唑處理對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。土壤真菌的PCoA分析結(jié)果(圖2B)所示，T1時(shí)期處理組兩個(gè)樣本與CK組距離不大，說明此時(shí)處理組與CK組群落結(jié)構(gòu)相似。T2、T3兩個(gè)時(shí)期的CK組與多效唑處理組有一定距離，說明土壤真菌群落結(jié)構(gòu)正在發(fā)生改變，T4時(shí)期處理組的樣本均分布在主成分1軸的負(fù)軸，CK組分布在主成分2軸的正軸，多效唑處理組與CK組的真菌群落相似性不高，表明處理組和CK組土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

2.5 微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò) 基于Pearson在科水平上的相關(guān)性構(gòu)建了土壤細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)(圖3)。拓?fù)涮匦酝ǔＳ糜诿枋黾?xì)菌和真菌相互關(guān)系的復(fù)雜模式[15]。在不同處理時(shí)期，不同的多效唑處理下，細(xì)菌和真菌的互作網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)發(fā)生了變化。T2時(shí)期，CK組網(wǎng)絡(luò)共現(xiàn)圖中節(jié)點(diǎn)數(shù)為318，而在D3和D30處理組中觀察到307和315個(gè)節(jié)點(diǎn)(表4)。相比之下，CK組網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜、連接更緊密。多效唑處理組網(wǎng)絡(luò)的正相關(guān)比例降低，網(wǎng)絡(luò)密度和網(wǎng)絡(luò)圖平均度也均

表4 拓?fù)涮匦?/p>

3 討論

通過多效唑在熱區(qū)土壤中降解率變化研究表明：多效唑具有較長(zhǎng)的半衰期，可長(zhǎng)期存在于土壤中。Bhattacherjee等人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多效唑在土壤中的殘留量為3.51mg/kg時(shí)，處理初期降解較快，后期逐漸變慢，其在土壤中殘留可長(zhǎng)達(dá)300d[16]，與本文研究結(jié)果相似。施藥150d后，低濃度多效唑處理組降解率低于高濃度多效唑處理組。多效唑在土壤中的降解率可能受到多種因素的影響。土壤微生物對(duì)多效唑的降解起重要作用，一些微生物可以降解多效唑，利用其作為碳源維持自身生長(zhǎng)，微生物的組成和數(shù)量可以改變微生物降解土壤中多效唑速度[17-19]。當(dāng)土壤中多效唑殘留濃度較低時(shí)，微生物對(duì)多效唑的利用效率較低，可能利用其它有機(jī)物維持生長(zhǎng)[20]。

土壤微生物在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分循環(huán)、能量流動(dòng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21]，微生物活性、多樣性對(duì)土壤肥力和植物生長(zhǎng)有一定影響[22-23]。研究多效唑?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊?，?duì)熱區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。土壤微生物彼此之間存在復(fù)雜的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)[24]，單一分析土壤細(xì)菌或真菌的群落結(jié)構(gòu)變化和多樣性不能全面評(píng)估施用多效唑?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊憽１疚牟捎酶咄繙y(cè)序技術(shù)研究了多效唑?qū)釁^(qū)土壤細(xì)菌和真菌的影響，同時(shí)構(gòu)建土壤細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析了施用多效唑?qū)ξ⑸锘プ骶W(wǎng)絡(luò)的影響。物種組成分析表明，經(jīng)多效唑處理后，土壤細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)菌門和屬的相對(duì)豐度發(fā)生變化，不同處理時(shí)期，變化程度和趨勢(shì)不同。子囊菌門、壺菌門、擔(dān)子菌門相對(duì)豐度都隨著施藥處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。施用多效唑150d后，放線菌門相對(duì)豐度均下降，芽單胞菌門、擬桿菌門相對(duì)豐度均增加。處理組曲霉菌屬相對(duì)豐度隨著處理時(shí)間的增加逐漸降低。Xu等[25]報(bào)道了曲霉屬是對(duì)農(nóng)藥有降解作用的真菌屬，曲霉菌屬相對(duì)豐度升高，可能對(duì)多效唑原藥起到一定降解作用。相對(duì)豐度>1%的土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌屬中包含鐮刀菌屬，伴隨著一些有防治病害功能的菌屬相對(duì)豐度降低，鐮刀菌屬的存在有可能會(huì)引起植物萎焉、根腐、穗腐等各種類型的植物病害發(fā)生[26]。但隨著施藥時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組鐮刀菌屬相對(duì)豐度下降，表明施用多效唑可能會(huì)減少作物受鐮刀菌屬侵害。

微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)越復(fù)雜代表微生物可利用的養(yǎng)分越高，微生物間相互作用加強(qiáng)，有助于菌群更有效地利用養(yǎng)分[27]。低濃度多效唑處理10d時(shí)促進(jìn)了土壤細(xì)菌多樣性增加，對(duì)真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響，同時(shí)降低了土壤細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度。表明多效唑影響了微生物間相互作用，此外，網(wǎng)絡(luò)圖平均度下降、平均聚類系數(shù)的減少和平均路徑長(zhǎng)度的增加進(jìn)一步證明了多效唑?qū)е挛⑸镏g的相互作用減弱，可能會(huì)阻礙養(yǎng)分的有效運(yùn)輸[28]。處理150d后，細(xì)菌菌群多樣性降低，真菌菌群的多樣性上升，微生物群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化，芽單胞菌門相對(duì)豐度增加，芽單胞菌門偏向于在營(yíng)養(yǎng)不良的土壤中生存[15]，表明此時(shí)可能土壤養(yǎng)分失衡，土壤養(yǎng)分變化導(dǎo)致了細(xì)菌和真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[29]。處理后期細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)逐漸恢復(fù)，土壤細(xì)菌和真菌相互聯(lián)系增加，真菌界與細(xì)菌界間相互作用的優(yōu)勢(shì)菌門屬可能均發(fā)生改變。

高濃度多效唑處理持續(xù)影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，可能由于多效唑在結(jié)構(gòu)上與三唑類殺菌劑類似，對(duì)真菌影響較大[8]。處理前期，土壤細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性降低，微生物之間的相互作用減弱，酸桿菌門相對(duì)豐度持續(xù)降低，酸桿菌門在與其它微生物互作中發(fā)揮著重要的作用[30]，這些重要菌屬的相對(duì)豐度改變，表明此時(shí)互作微生物可能正在發(fā)生較大改變?；プ骶W(wǎng)絡(luò)圖中正相互作用減少，施用多效唑可能影響土壤微生物協(xié)同作用，引起不同群落對(duì)土壤養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)[31]。其他研究也發(fā)現(xiàn)，施用高劑量多效唑會(huì)對(duì)土壤養(yǎng)分有負(fù)面影響[32]。處理150d后，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，真菌菌群豐富度顯著上升，高濃度多效唑長(zhǎng)期脅迫可能導(dǎo)致部分微生物死亡，進(jìn)而成為碳源促進(jìn)真菌生長(zhǎng)[33]。隨著施藥時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度多效唑?qū)?xì)菌和真菌群落間相互作用的干擾不斷減少，細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)逐漸恢復(fù)到CK組水平，正相互作用增加，土壤細(xì)菌和土壤真菌菌群協(xié)同作用加強(qiáng)，可能利于土壤中多效唑的降解。也有其他研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和真菌的協(xié)同作用可促進(jìn)土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴降解[34]。細(xì)菌在土壤微生物群落中所占的比例較大，群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，其通過與真菌直接或間接的相互作用可能會(huì)促進(jìn)微生物群落的恢復(fù)。

4 結(jié)論

施用多效唑會(huì)改變土壤細(xì)菌和真菌群落組成，如能改變變形菌門、酸桿菌門、子囊菌門、壺菌門的相對(duì)豐度。多效唑處理可降低土壤細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度處理會(huì)降低土壤細(xì)菌菌群多樣性，并導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化；高濃度多效唑處理對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)造成一定影響，同時(shí)也對(duì)細(xì)菌和真菌互作網(wǎng)絡(luò)造成干擾，影響細(xì)菌和真菌的相互作用。施用推薦濃度和高濃度的多效唑都可能會(huì)在土壤中長(zhǎng)期殘留，導(dǎo)致土壤微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。