劉廣平，劉 萱，賀曉龍，2，趙瑞華，2，劉月芹，高小朋，任桂梅

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心；3.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；陜西延安716000)

思?jí)殉喙?Strophariarugosoannulata)隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、球蓋菇科、球蓋菇屬，是適合我國(guó)北方地區(qū)種植的一種珍稀食用菌。思?jí)殉喙焦叫螆A整、色澤艷麗，子實(shí)體中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[1，2]，其鮮菇肉質(zhì)細(xì)嫩，口感極好，享有“山林珍品”的美譽(yù)[3]。思?jí)殉喙骄哂蟹浅V闊的種植利用前景：一是思?jí)殉喙娇芍苯邮褂蒙辖臃N栽培，非常容易成活繁殖；二是思?jí)殉喙娇稍诟鞣N秸稈培養(yǎng)料(如稻草、麥秸、亞麻稈等)上生長(zhǎng)，不僅能充分利用田間秸稈保護(hù)環(huán)境，其栽培后的菌渣廢料還可直接作為肥料還田，增強(qiáng)土壤肥力[3]；三是思?jí)殉喙娇鼓嫘詮?qiáng)，生長(zhǎng)繁殖的適應(yīng)溫度范圍廣，在5℃-30℃范圍均可出菇[4]，便于于調(diào)整上市時(shí)間，可在其他蕈菌或蔬菜淡季時(shí)投放市場(chǎng)，滿足廣大消費(fèi)者的需求。

目前國(guó)內(nèi)外思?jí)殉喙降难芯恐饕性谂囵B(yǎng)基配方優(yōu)化和栽培技術(shù)改良，而對(duì)其母種培養(yǎng)基的研究探索鮮見(jiàn)報(bào)道。眾所周知，菌類母種是影響食用菌種植的關(guān)鍵因素，母種的質(zhì)量水平直接決定了后續(xù)菌類種植的質(zhì)量水平和產(chǎn)量高低[5]，思?jí)殉喙侥阜N的優(yōu)劣在很大程度上限制了后續(xù)的生產(chǎn)實(shí)踐研究。因此，本研究對(duì)思?jí)殉喙侥阜N培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化篩選，旨在選擇適合思?jí)殉喙侥阜N生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，為后續(xù)的生產(chǎn)實(shí)踐研究提供支持和幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種、藥品及試劑

思?jí)殉喙絃-1由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

葡萄糖、果糖、MgSO4、NH4Cl、NaNO3、KH2PO4、CaCl2、ZnSO4等均購(gòu)自上海滬試，為國(guó)產(chǎn)分析純。pH調(diào)節(jié)液：鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)。

1.1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰)。高壓滅菌器(日本三洋)。電子天平(日本島津)。超純水機(jī)(美國(guó)密理博)。pH計(jì)(上海雷磁)。隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯去皮切塊，煮沸后8層紗布過(guò)濾，濾液加18 g瓊脂融化定容至1000 mL，30 min，121℃滅菌[6]。

(2)篩選碳源培養(yǎng)基：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉作為碳源，制成篩選碳源培養(yǎng)基，30 min，121℃滅菌。

(3)篩選氮源培養(yǎng)基：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入蛋白胨和酵母膏2種有機(jī)氮及NH4Cl、NaNO3和KNO33種無(wú)機(jī)氮作氮源，制成篩選氮源培養(yǎng)基，30 min，121℃滅菌。

(4)篩選無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入MgSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2和ZnSO4等無(wú)機(jī)鹽，制成篩選無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，30 min，121℃滅菌[1，7-11]。

(5)對(duì)比培養(yǎng)基：以按正交試驗(yàn)的配方制備培養(yǎng)基，30 min，121℃滅菌。

1.2.2 pH篩選試驗(yàn)

滅菌后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基于無(wú)菌環(huán)境下倒入9 cm滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中裝16 mL培養(yǎng)基，冷卻后制成培養(yǎng)平板。將活化的思?jí)殉喙侥阜N菌絲切成大小9 mm3的菌塊，無(wú)菌條件下接種于培養(yǎng)平板中央。分別設(shè)pH 4、5、6、7、8、9、10等7個(gè)pH梯度，每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)，23℃暗光培養(yǎng)。待接種塊菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)時(shí)測(cè)量菌絲體長(zhǎng)度，直至菌絲體長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿表面，記錄菌絲長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)速度。

1.2.3 碳源篩選試驗(yàn)

將各種滅菌后的碳源篩選培養(yǎng)基倒入9 cm滅菌培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)平板，無(wú)菌條件下接入大小9 mm3活化的思?jí)殉喙骄鷫K，每種碳源設(shè)5個(gè)重復(fù)，23℃暗光培養(yǎng)。確定最適碳源后再設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1%、2%、3%、4% 5個(gè)梯度接入9 mm3活化的思?jí)殉喙骄鷫K，繼續(xù)培養(yǎng)，記錄菌絲長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)速度。

1.2.4 氮源篩選試驗(yàn)

將滅菌后的氮源篩選培養(yǎng)基倒入9 cm滅菌培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)平板，無(wú)菌條件下接入大小9 mm3活化的思?jí)殉喙骄鷫K，每種氮源設(shè)5個(gè)重復(fù)，23℃暗光培養(yǎng)。確定最適氮源后再設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 5個(gè)梯度接入9 mm3活化的思?jí)殉喙骄鷫K繼續(xù)培養(yǎng)，記錄菌絲長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)速度。

1.2.5 無(wú)機(jī)鹽篩選試驗(yàn)

將滅菌后的無(wú)機(jī)鹽篩選培養(yǎng)基，倒入9 cm滅菌培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)平板，無(wú)菌條件下接入大小9 mm3活化的思?jí)殉喙骄鷫K，每種無(wú)機(jī)鹽設(shè)5個(gè)重復(fù)，23℃暗光培養(yǎng)。確定最適無(wú)機(jī)鹽后再設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 5個(gè)梯度接入9 mm3活化的思?jí)殉喙骄鷫K繼續(xù)培養(yǎng)，記錄菌絲長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)速度。

1.2.6 思?jí)殉喙侥阜N培養(yǎng)基配方的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)篩選出適合思?jí)殉喙侥阜N菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源、最佳氮源、最佳無(wú)機(jī)鹽和最佳pH4個(gè)條件的基礎(chǔ)上，以L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。通過(guò)極差分析篩選影響菌絲生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，結(jié)合菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)分析最終確定適合思?jí)殉喙侥阜N生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方。

表1 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)方案

1.2.7 優(yōu)化前后培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)情況比較

將活化的思?jí)殉喙骄z切成9 mm3的菌塊，無(wú)菌條件下接種于分別基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)基上，23℃暗光培養(yǎng)，記錄菌絲長(zhǎng)度，比較二者的生長(zhǎng)速度。

2 結(jié)果及分析

2.1 pH試驗(yàn)

思?jí)殉喙侥阜N菌絲對(duì)pH適應(yīng)范圍比較廣，但不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)有較大的影響。不同pH下菌絲的生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)pH為4時(shí)菌絲僅萌發(fā)而不伸長(zhǎng)；pH<5時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢；pH為6-8時(shí)菌絲生長(zhǎng)較快，生長(zhǎng)速度超過(guò)3 mm/d。其中pH為7時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)到最快，為3.61±0.16 mm/d，認(rèn)為此時(shí)的pH是思?jí)殉喙骄z生長(zhǎng)的最合適pH。當(dāng)pH>10時(shí)菌絲生長(zhǎng)又會(huì)降低，而pH為11菌絲幾乎不萌發(fā)。

2.2 碳源篩選結(jié)果

思?jí)殉喙綄?duì)單糖的利用能力較好，在果糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為3.7±0.12 mm/d，葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度為3.82±0.14 mm/d，所以葡萄糖可作為最佳碳源。而對(duì)雙糖和多糖的利用能力較差，在以麥芽糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較為緩慢，在蔗糖碳源的培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)極弱，生長(zhǎng)速度僅為0.35±0.10 mm/d，結(jié)果如圖2所示。

不同濃度葡萄糖影響思?jí)殉喙骄z生長(zhǎng)的結(jié)果見(jiàn)圖3。培養(yǎng)基中無(wú)葡萄糖碳源，菌絲可以保持較低的基礎(chǔ)生長(zhǎng)，約為2.75±0.15 mm/d。隨葡萄糖濃度升高，菌絲生長(zhǎng)速度呈先升高后降低的趨勢(shì)。在2%時(shí)達(dá)到頂峰，約為3.82±0.14 mm/d，而到4%時(shí)卻降低到3.01±0.18 mm/d，所以2%是培養(yǎng)基中葡萄糖的最佳添加濃度。

2.3 氮源篩選結(jié)果

思?jí)殉喙降牡幢容^廣，但不同氮源培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度不同?？傮w看來(lái)，有機(jī)氮的供應(yīng)效果優(yōu)于無(wú)機(jī)氮，菌絲在有機(jī)氮源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度快于無(wú)機(jī)氮源培養(yǎng)基。菌絲在蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度分別為3.72±0.22 mm/d和3.48±0.15 mm/d，均超過(guò)無(wú)機(jī)氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快的硝酸鉀氮源3.16±0.11 mm/d的速度(圖4)，因此，選擇蛋白胨作為思?jí)殉喙脚囵B(yǎng)基的最適氮源。

思?jí)殉喙骄z生長(zhǎng)速度隨培養(yǎng)基中蛋白胨濃度改變的結(jié)果見(jiàn)圖5。隨蛋白胨濃度逐漸升高，菌絲生長(zhǎng)速度也慢慢增加，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.3%，菌絲生長(zhǎng)最快，然后又隨蛋白胨濃度升高而降低，表明培養(yǎng)基中蛋白胨的最佳濃度為0.3%。

2.4 無(wú)機(jī)鹽的篩選

無(wú)機(jī)鹽對(duì)思?jí)殉喙降挠绊懭鐖D6所示，在MgSO4培養(yǎng)基上，思?jí)殉喙降纳L(zhǎng)速度達(dá)到3.61±0.12 mm/d，遠(yuǎn)高于在CaCl2、KH2PO4和NaCl培養(yǎng)基上的速度。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌絲在ZnSO4培養(yǎng)基上幾乎不能萌發(fā)生長(zhǎng)，表明鋅對(duì)菌絲生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用，因此，將MgSO4添加到培養(yǎng)基中以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。

當(dāng)MgSO4濃度由0%高到0.3%時(shí)，思?jí)殉喙骄z生長(zhǎng)速度逐漸增加，在0.3%時(shí)到達(dá)最大值3.61±0.12 mm/d。而MgSO4濃度繼續(xù)升高到0.4%時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)速度反而受到抑制，菌絲生長(zhǎng)速度下降為3.16±0.15 mm/d。因此，選擇0.3%為MgSO4添加的最適濃度(見(jiàn)圖7)。

2.5 思?jí)殉喙侥阜N培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

先通過(guò)4個(gè)單因素試驗(yàn)篩選出了適合思?jí)殉喙侥阜N生長(zhǎng)的最佳碳源葡萄糖、最佳氮源蛋白胨、最佳無(wú)機(jī)鹽MgSO4和最佳pH為7的4個(gè)單因素，每個(gè)因素再分別取3個(gè)水平，并以L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)[13，14]。表2為正交試驗(yàn)的優(yōu)化試驗(yàn)及處理結(jié)果。

表2 優(yōu)化培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

由表2可以看出，配方7的菌絲生長(zhǎng)速度最快，可達(dá)到4.86±0.12 mm/d；其次是配方6，達(dá)到4.01±0.14 mm/d；配方1和配方3生長(zhǎng)速度最慢。通過(guò)極差分析表明4個(gè)因素對(duì)思?jí)殉喙侥阜N菌絲長(zhǎng)速影響大小順序分別為：葡萄糖>pH>MgSO4>蛋白胨，碳源對(duì)思?jí)殉喙骄z生長(zhǎng)的影響最強(qiáng)，pH和無(wú)機(jī)鹽次之，氮源的影響最小，結(jié)合菌絲生長(zhǎng)濃密程度和潔白程度等指標(biāo)得出思?jí)殉喙脚囵B(yǎng)條件的最佳組合為A3B1C3D2，培養(yǎng)基配方為：葡萄糖2.5%、蛋白胨0.25%、MgSO40.35%、pH=7。

2.6 優(yōu)化前后培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)情況比較結(jié)果

優(yōu)化前菌絲體生長(zhǎng)速度為3.61±0.16 mm/d，優(yōu)化后菌絲體生長(zhǎng)速度為4.86±0.12 mm/d，且優(yōu)化后的培養(yǎng)基菌絲體濃密度和潔白度明顯優(yōu)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的菌絲狀態(tài)(見(jiàn)表3)，表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基明顯優(yōu)于優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

表3 優(yōu)化前后培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)情況比較結(jié)果

注釋：“+”表示菌絲潔白和濃密程度，越多表示菌絲生長(zhǎng)越旺盛、活力越高。

3 討論

本研究對(duì)思?jí)殉喙骄甑哪阜N生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化研究。首先進(jìn)行了碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和pH的4個(gè)單因素篩選，確定了適合此菌株母種生長(zhǎng)的最佳碳源、最佳氮源、最佳無(wú)機(jī)鹽和最佳pH，優(yōu)化了各自的最合適濃度。其次進(jìn)行了L9(34)水平的正交試驗(yàn)，通過(guò)極差分析篩選出對(duì)思?jí)殉喙侥阜N生長(zhǎng)有顯著影響的因子，并綜合菌絲長(zhǎng)勢(shì)得到適合思?jí)殉喙侥阜N生長(zhǎng)的較優(yōu)組合。最后比較了配方優(yōu)化前后培養(yǎng)基菌絲的生長(zhǎng)情況，進(jìn)一步證明優(yōu)化后的培養(yǎng)基較優(yōu)化前的培養(yǎng)基更適合菌株母種生長(zhǎng)，最終確定思?jí)殉喙骄昴阜N培養(yǎng)基的最佳配方為土豆200 g，葡萄糖2.5%，蛋白胨0.25%，MgSO40.35%，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 7。

食用菌的培養(yǎng)目的不同，所需培養(yǎng)基的成分和比例也不盡相同，其成分的細(xì)微變化都將影響食用菌菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)。本研究?jī)?yōu)化獲得的思?jí)殉喙侥阜N培養(yǎng)基對(duì)菌株母種的繁殖擴(kuò)培具有指導(dǎo)意義。或許不能完全滿足生產(chǎn)出菇的需要，因此，優(yōu)化篩選適合規(guī)?；a(chǎn)的最佳培養(yǎng)基還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。