羅 鋼，崔永晨，曹 越，張俊峰

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院麻醉科，上海200233

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是麻醉手術后常見的中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥。術后認知研究國際協(xié)作組最近建議將POCD 更名為圍術期神經認知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND），指術前與術后12 個月內發(fā)生的包括術后譫妄在內的所有圍術期認知功能改變[1]。因本實驗僅研究術后出現的以學習記憶功能下降為主要表現的神經認知功能障礙，故仍采用POCD 這一術語。POCD 可導致患者長期的認知、學習和記憶功能障礙，影響患者的生活質量，增加患者及社會的醫(yī)療負擔和費用[2-3]，但其發(fā)病機制目前尚未闡明。隨著老齡化社會的到來，每年有超過30%的65 歲以上老年人經歷手術創(chuàng)傷，所以POCD 所帶來的健康問題和經濟負擔將會逐年加重[4]，因此研究POCD 的發(fā)病機制具有重要的臨床和社會意義。

糖尿病是認知功能受損的獨立危險因素之一，合并糖尿病時POCD 的發(fā)生率明顯增高[5]。動物實驗[6]已證實糖尿病小鼠更容易發(fā)生POCD，其原因在于手術創(chuàng)傷導致糖尿病本身存在的中樞神經炎癥反應加重。最新研究[7]顯示小膠質細胞需通過改變其糖代謝功能維持其經典致炎途徑的激活狀態(tài)，進而釋放大量炎癥介質導致中樞神經炎癥反應。然而，手術創(chuàng)傷誘導的小膠質細胞激活伴隨的糖代謝功能改變是否參與POCD 的發(fā)生目前還不明確。

正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）是一種基于放射性核素顯像的功能成像技術，目前已被廣泛應用于認知功能的機制研究[8]。通過對葡萄糖類似物18F-氟代脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）的追蹤顯影，PET/CT 可以客觀展現腦內葡萄糖代謝的功能變化。本研究擬采用行為學及PET/CT 影像學技術，觀察手術創(chuàng)傷對2 型糖尿病小鼠學習記憶功能影響及相關腦區(qū)葡萄糖代謝水平的變化，初步探討POCD 發(fā)生的能量代謝機制。

1 對象與方法

1.1 2 型糖尿病小鼠模型的建立及分組

SPF 級C57BL/6 野生型雄性小鼠40 只，4 周齡，體質量（16±2）g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005；小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院實驗動物中心，使用許可證號為SCXK（滬）2016-0020，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度約為25 ℃。操作規(guī)范均遵照《醫(yī)學實驗動物管理實施細則》《國家實驗動物管理條例》，并通過上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院動物倫理委員會批準。

參照文獻[9]的方法，選取4周齡小鼠，常規(guī)飲食適應性喂養(yǎng)1周后開始60%高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飲食喂養(yǎng)第5 周，小鼠禁食16 h 后腹腔注射煙酰胺240 mg/kg，15 min 后腹腔注射鏈脲佐菌素（用pH 4.5 的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液溶解）60 mg/kg，1 次/d（煙酰胺+鏈脲佐菌素），連續(xù)注射3 d。末次注射后72 h 檢測空腹血糖（禁食12 h） ≥ 11.1 mmol/L 表示2型糖尿病模型造模成功。最終本實驗獲得成功建模的2 型糖尿病小鼠30 只，記錄小鼠體質量及一般情況，然后分2 批進行實驗。第1 批選擇模型小鼠20 只，隨機分為對照組和腹部手術創(chuàng)傷組（手術組），10 只/組，用于術后行為學測試。術前將小鼠放入條件恐懼測試箱中進行適應性訓練，由測試者從飼養(yǎng)盒輕柔抓取和放回，每日適應5 min，連續(xù)3 d；術后第3 日檢測空腹血糖水平。為確保術后學習記憶功能和腦影像學功能改變時間上的一致性，第2 批10 只模型小鼠同樣隨機分為對照組和手術組，5 只/組，在術后第3 日進行腦部PET/CT 的檢測。

1.2 腹部手術創(chuàng)傷小鼠模型的建立

參照文獻[10-11]的方法構建腹部手術創(chuàng)傷小鼠模型。采用4%異氟烷吸入麻醉誘導，2%異氟烷面罩吸入麻醉維持（氧流量1 L/min）。術中持續(xù)監(jiān)測血氧飽和度和呼吸（美國Datex-Ohmeda 監(jiān)護儀），避免低氧和呼吸抑制。小鼠仰臥固定于37 ℃恒溫加熱板上。常規(guī)消毒鋪巾，腹部正中做一長約1.5 cm 的切口，充分暴露腸管后鈍性游離腸系膜上動脈，用微血管夾夾閉腸系膜上動脈一級分支30 min 后開放，然后用無菌絲線縫合肌肉筋膜和皮膚，整個手術過程持續(xù)約45 min。術畢皮下注射生理鹽水（36 ℃，1 mL）+舒芬太尼（1 μg/kg），之后每隔12 h注射1 次，共注射3 次。對照組小鼠采用100% O2吸入45 min。術后48 h 進行條件恐懼記憶實驗的訓練，術后第3 日分別進行曠場實驗和條件恐懼記憶實驗行為學測試。

1.3 曠場實驗

術后第3 日進行曠場實驗，采用自發(fā)活動記錄分析系統(tǒng)（美國Coulbourn，ACT-300A）觀察小鼠的運動和探索行為。將小鼠放入實驗箱（30 cm×30 cm×40 cm）中部開始自由探索5 min，視頻錄像后自動分析小鼠的運動總路程和中央格穿越次數。每只小鼠測試后使用75%乙醇清洗實驗箱。

1.4 條件恐懼記憶實驗

分為訓練、場景相關性記憶測試和聲音相關性記憶測試3 個階段，同樣采用自發(fā)活動記錄分析系統(tǒng)。每只小鼠測試后使用75%乙醇清洗測試箱。

（1）訓練階段 術后48 h 將小鼠放在測試箱中適應180 s 之后，給予30 s 的聲音刺激（80 dB，3 600 Hz），聲音刺激的最后2 s 給予足底電擊（0.8 mA），此訓練重復3次。然后繼續(xù)停留30 s 后放回飼養(yǎng)籠。訓練階段在陰暗環(huán)境下進行。

（2）場景相關性記憶測試 小鼠于訓練階段完成24 h后（即術后第3 日），將小鼠放入測試箱中觀察360 s，場景與訓練時完全相同，不予聲音和電刺激，視頻錄像后自動分析小鼠的僵直反應時間。測試結束放回飼養(yǎng)籠。通過Freeze Frame 4 軟件進行結果分析。計算總時相中小鼠的僵直反應時間占總觀察時間的比例用于評估小鼠的記憶 功能。

（3）聲音相關性記憶測試 場景相關性記憶測試后2 h，將小鼠被放入場景完全改變的測試箱（包括形狀、顏色、氣味及明暗）中觀察360 s，期間隨機給予與訓練階段相同的聲音刺激3 次，每次持續(xù)60 s，視頻錄像后自動分析小鼠的僵直反應時間。通過Freeze Frame 4 軟件進行結果分析。計算聲音刺激時相中小鼠的僵直反應時間占總觀察時間的比例，用于評估小鼠的記憶功能。

1.5 PET/CT 檢測

對照組和手術組小鼠在術后第3 日進行PET/CT 檢查。檢查前小鼠禁食12 h，以減少或避免因血糖因素對18F-FDG 在小鼠腦內代謝分布的影響。尾靜脈注射300 μCi18F-FDG 30 min 后，5%異氟烷麻醉小鼠，俯臥位固定于帶保溫裝置的掃描板上，采用Siemens Inveon MicroPET/CT 成像系統(tǒng)進行頭部顯像。掃描視野包含小鼠整個腦部及頸部，采用3D 模式采集圖像，濾波反投影法重建小鼠軸面、矢狀面、冠狀面斷層圖像進行分析，通過PMOD軟件（PMOD Technologies，瑞士）進行PET/CT 圖像融合并分析18F-FDG 在小鼠各腦區(qū)平均攝取率。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般資料

與對照組相比，手術組小鼠的體質量[ （34.067± 3.678） g vs （33.467±2.579） g，P=0.810]、 術前血糖[ （13.633±2.156） mmol/L vs （13.620±1.807） mmol/L，P=0.791]和術后第3 日血糖[ （13.514±2.812） mmol/L vs （13.746±2.418） mmol/L，P=0.814]差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 曠場實驗

曠場實驗結果（圖1）顯示，2 組小鼠的中央格穿越次數和運動總路程差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 條件性恐懼實驗

與對照組比較，手術組術后第3 日場景相關性記憶測試和聲音相關性記憶測試中僵直時間比例均顯著降低（均P＜0.05，圖2）。

圖1 曠場實驗的中央穿越格次數（A）和總移動距離（B）的比較Fig 1 Comparison of number of central grid crossings (A) and total moving distance (B) in open field experiment

圖2 條件性恐懼實驗場景測試和聲音測試僵直時間比例的比較Fig 2 Comparison of freezing time ratio in contextual test and tone-related test in fear conditioning experiment

2.4 18F-FDG 在各腦區(qū)的平均攝取率

基于PET/CT 融合圖像，采用相同色標，由黑色到紅色依次顯示由低到高的18F-FDG 攝取率。結果顯示，手術組小鼠海馬（hippocampus，HIP）、皮質（cortex，CTX）、紋 狀 體（corpus striatum，CPu） 和 杏 仁 核（amygdala，AMY）的18F-FDG 平均攝取率均顯著高于對照組（均P＜0.05）；小腦（cerebellum，CB）、中腦（midbrain，MID）的平均攝取率的組間比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖3）。

圖3 小鼠各個腦區(qū)對18F-FDG 的攝取率Fig 3 Uptake rate of 18F-FDG in each brain region of mice

3 討論

條件性恐懼實驗是評估術后認知功能障礙的有效方法，其中場景相關性記憶主要檢測海馬相關性記憶功能，而聲音相關性記憶則可以檢測杏仁核、紋狀體及前額皮質（prefrontal cortex，PFC）等海馬非依賴性記憶功能[12]。本研究結果顯示，2 型糖尿病小鼠手術后第3 日在條件性恐懼實驗中的場景相關性記憶測試及聲音相關性記憶測試中的僵直反應比例均較對照組明顯縮短，說明手術創(chuàng)傷可導致糖尿病小鼠術后海馬相關性和非海馬相關性記憶 受損。

本項目組前期研究[13]表明麻醉手術創(chuàng)傷引起的中樞神經炎癥反應是POCD 發(fā)生的重要原因，而小膠質細胞激活釋放炎癥介質在此過程中扮演著重要角色。Gimeno-Bayón 等[14]研究發(fā)現，小膠質細胞被炎癥刺激激活后出現糖代謝功能的改變，表現為由氧化磷酸化代謝轉變?yōu)橛醒跆墙徒獯x狀態(tài)，這種現象被稱為代謝重編程（metabolic reprogramming）。糖代謝重編程的意義在于：①更加快速地為激活狀態(tài)的小膠質細胞提供能量。②有氧糖酵解的中間代謝物可以為激活狀態(tài)的小膠質細胞合成炎癥介質等活性物質提供重要的前體。并且有研究[7]證實改變小膠質細胞的能量狀態(tài)可有效調控其激活狀態(tài)。Hovens 等[15]研究發(fā)現，手術創(chuàng)傷后1 周內可觀察到海馬、紋狀體、杏仁核及前額皮質等腦區(qū)的小膠質細胞激活。本研究采用腦部18F-FDG PET/CT 檢查發(fā)現術后第3 日海馬、杏仁核、紋狀體和皮質腦區(qū)的葡萄糖攝取率顯著增加，提示手術創(chuàng)傷導致2 型糖尿病小鼠術后相應腦區(qū)的葡萄糖代謝增強。由此可見，手術創(chuàng)傷導致2 型糖尿病小鼠認知功能障礙、小膠質細胞激活狀態(tài)及腦糖代謝功能改變在時間和空間上的相關性，提示手術創(chuàng)傷誘導的小膠質細胞激活所伴隨的腦部能量狀態(tài)改變是導致POCD 發(fā)生的可能機制。

本研究也存在一些不足之處：①由于POCD 機制尚不明確，POCD 動物模型的建立缺乏公認的標準，目前國內外學者傾向于通過動物組間行為學差異來判斷認知功能變化。本研究根據臨床實踐結合文獻報道選擇了腹部創(chuàng)傷手術模型，行為學結果也證實了該模型建立的有效性。② 本研究并未比較術后認知功能和腦糖代謝功能在糖尿病小鼠和正常小鼠之間的差異，但已有文獻報道糖尿病可加重手術創(chuàng)傷導致的POCD 和海馬炎癥反應[16-17]?？紤]到糖尿病本身合并糖代謝紊亂，糖尿病手術患者更加容易發(fā)生POCD，我們以2 型糖尿病小鼠為研究對象探討POCD 和腦糖代謝功能改變之間的關系就更具有臨床意義。③手術創(chuàng)傷可能會導致應激性高血糖，本研究并未監(jiān)測術中及術后早期的血糖水平改變，但本研究監(jiān)測了術前及術后第3日的血糖水平，結果顯示組間均無明顯差異，由此可以排除術后第3 日血糖水平變化對腦糖代謝功能的影響。④本研究僅觀察到2 型糖尿病小鼠POCD 和認知功能相關腦區(qū)的糖代謝異常在時間和空間上的相關性，但并不能充分證明兩者之間的因果關系，未來還需要通過糖代謝重編程的干預性研究予以明確。然而，本研究從腦能量代謝功能異常方面探索POCD 的機制，為該疾病的研究提供了新視角。

綜上所述，2 型糖尿病小鼠術后出現的認知功能障礙可能與手術創(chuàng)傷導致的學習記憶相關腦區(qū)葡萄糖代謝功能異常有關，其具體調控機制還有待進一步研究明確。

參·考·文·獻

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