羅冰潔，李盛陶，王 寧，高曉冬

江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室, 無錫 214122

先天性糖基化疾?。╟ongenital disorder of glycosylation，CDG）是由糖鏈合成缺陷引起的先天性新陳代謝紊亂遺傳病，可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的精神運動遲緩和多器官衰竭[1-2]，大多數(shù)CDG 由糖基轉(zhuǎn)移酶功能的異常引起。

α-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-mannosyltransferase，ALG3）基因編碼的蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）腔內(nèi)，具有多個跨膜域，以多萜醇磷酸甘露糖（dolichylphosphomannose，Dol-P-Man） 為 供 體、Dol-PPGlcNAc2-Man5（DP-Gn2-M5）為受體[3]，在N-糖鏈α-1,6 連接的甘露糖上添加α-1,3 連接的甘露糖殘基，是蛋白N-糖基化前體多萜醇寡糖（dolichol-linked oligosaccharide，DLO）合成途徑中的重要蛋白。人體ALG3 蛋白發(fā)生突變會使DLO 合成受阻，積累糖鏈中間體GlcNAc2-Man5（Gn2-M5）而導(dǎo)致蛋白糖基化異常，引起ALG3-CDG。ALG3-CDG 患者的共同臨床特征包括畸形特征（小頭畸形、面部畸形等）、精神運動遲緩、癲癇和體質(zhì)量增加緩慢[4-6]、肌張力異常和舞蹈病等[6-7]。研究[4-5,8-9]發(fā)現(xiàn)，不同ALG3-CDG 患者表現(xiàn)出的疾病嚴(yán)重程度，包括患者的壽命等均存在差異，其根本原因是ALG3 蛋白發(fā)生突變的位點不同而導(dǎo)致酶活性下降的程度不同。

DLO 合成途徑在幾乎所有真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有保守性，因此可以使用酵母作為模板研究人類CDG 相關(guān)ALG 突變蛋白的致病性。將酵母ALG 基因突變或敲除后，由于蛋白合成過程異常會導(dǎo)致酵母出現(xiàn)溫度敏感的生長缺陷，再將CDG 相關(guān)的人ALG 突變體轉(zhuǎn)入生長缺陷的酵母中，根據(jù)其能否回補(bǔ)酵母的生長缺陷來確定此突變位點是否具有致病性[10-11]。然而研究者發(fā)現(xiàn)，ALG3 基因敲除的酵母菌沒有明顯生長缺陷，需要同時敲除寡糖基轉(zhuǎn)移酶（oligosaccharyl transferase，OST）的一個亞基，才能使酵母出現(xiàn)一定的溫度敏感生長缺陷，再通過回補(bǔ)實驗來衡量ALG3 突變蛋白的活性與ALG3-CDG 疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性[12-15]。此方法操作復(fù)雜且靈敏度低，導(dǎo)致許多ALG3-CDG 相關(guān)突變的致病性尚未得到確認(rèn)[4-5,16]，因此開發(fā)一種直觀、簡潔的檢測方法具有非常重要的意義和應(yīng)用 前景。

本實驗室前期研究[17]利用大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）表達(dá)了酵母ALG1 蛋白及其突變體，開發(fā)了體外ALG1 蛋白活性的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS） 定 量檢測方法，并利用該方法對ALG1-CDG 患者的疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行了分析。隨后為了探究ALG3-CDG 患者ALG3突變蛋白活性與疾病的關(guān)系，首先在釀酒酵母來源的ALG3 蛋白N-端引入相對分子質(zhì)量約13 000 的Mistic 標(biāo)簽，促進(jìn)其異源表達(dá)[18]，然后在大腸埃希菌體系中表達(dá)了Mistic-ALG3 重組蛋白，并利用LC-MS 的方法測定了該蛋白的活性[19-20]。在此基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)文獻(xiàn)[4-5,8-9]報道的ALG3-CDG 患者的蛋白突變情況對釀酒酵母ALG3 中的對應(yīng)保守性氨基酸進(jìn)行了定點突變，探究突變蛋白活性與ALG3-CDG 疾病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及菌株

PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit（Mighty Mix）、2×Taq Master Mix 購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、卡那霉素、氯霉素、脫脂奶粉、異丙基-β-D-硫代 半 乳 糖 苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 購于生工生物工程（上海）股份有限公司，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）、Immun-Star ? HRP 化學(xué)發(fā)光試劑盒、固相萃取空柱管（6 mL）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DNA 標(biāo)志物（1 kb plus DNA ladder）、蛋白標(biāo)志物（blue plus Ⅱ protein marker）、一抗（anti-His mouse monoclonal antibody）、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗[goat anti-mouse IgG（H+L） HRP conjugate]購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，固相萃取填料（supelclean ENVI-carb slurry）購于美國Sigma-Aldrich 公司，GDP-甘露糖（GDP-Man）購于青島糖科學(xué)生物技術(shù)有限公司，其他常用試劑及培養(yǎng)基購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司?；瘜W(xué)合成中使用到的蛋白質(zhì)均由本實驗室前期合成[17,20-21]。

大腸埃希菌生長培養(yǎng)基為LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和TB（Terrific-Broth）培養(yǎng)基，均由本實驗室自行配置?？剐耘囵B(yǎng)基是在上述滅菌培養(yǎng)基冷卻至55 ℃以下后，額外添加50 μg/mL 卡那霉素和/或34 μg/mL 氯霉素獲得。

本研究所用到的大腸埃希菌XL-10 Gold 和Rosetta（DE3）均為本實驗室保藏菌株。質(zhì)粒pET28a-Mistic-ALG3 由本實驗室構(gòu)建[19]。

1.2 主要儀器

PCR 儀（T100 Thermal Cycler）、SDS-PAGE 凝 膠 電泳儀（Mini-PROTEAN Tetra System）、蛋白轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot Turbo）均購于美國Bio-Rad 公司，凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-5200Multi）購于上海天能科技有限公司，高速冷凍離心機(jī)（CT15RE）購于日本HITACHI 公司，超高效液相色譜酰胺柱（UPLC BEH Amide Column）購于美國Waters 公司，超高效液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000 UPLC）、三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（TSQ Quantum Ultra EMR）購于美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 突變位點的確定 收集文獻(xiàn)[4-5,8-9]已報道的ALG3-CDG 患者ALG3 蛋白6 個突變位點（I69T、W71R、G96R、M157K、R171Q 和M209T），用Clustal X 軟件對人源ALG3突變蛋白與釀酒酵母ALG3 進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)這6 個突變位點均在釀酒酵母ALG3 中保守，氨基酸序列比對結(jié)果見圖1。并以此為依據(jù)設(shè)計了對應(yīng)的釀酒酵母ALG3 突變體（I70T、Y72R、G98R、L157K、R171Q 和M221T）。

圖1 釀酒酵母和人源ALG3 氨基酸序列同源比對Fig 1 Alignment of ALG3 in Saccharomyces cerevisiae (Sc) and Homo sapience (Hs)

1.3.2 融合PCR 構(gòu)建點突變質(zhì)粒 本研究所有突變質(zhì)粒的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[22]所述的融合PCR 方法。根據(jù)QuikChange Primer Design 網(wǎng)站在線設(shè)計突變引物，以質(zhì)粒pET28a-Mistic-ALG3 為模板進(jìn)行第1 次PCR。將第1次PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后作為引物，進(jìn)行第2 次PCR。所得PCR 產(chǎn)物按照常規(guī)方法進(jìn)行后續(xù)純化、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑取單克隆提質(zhì)粒測序驗證。Mistic-ALG3 突變蛋白的引物見表1。

表1 Mistic-ALG3 點突變引物Tab 1 Primers of mutations for Mistic-ALG3

1.3.3 蛋白表達(dá)及大腸埃希菌菌膜成分的制備 將pET28a-Mistic-ALG3 質(zhì)粒及各突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌Rosetta（DE3）中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接種至5 mL 抗性LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 搖床過夜培養(yǎng)（約12 h）后，按照體積的1%接種于抗性TB 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)至吸光度[D （600 nm）]為0.6 ～1.0，待培養(yǎng)基溫度降至16 ℃后添加終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，收集菌體于離心管中，用適量預(yù)冷的緩沖液[25 mmol/L Tris/HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl] 吹打混勻菌體；將離心管置于冰水混合物中超聲破碎，4 000×g、4 ℃離心15 min 后，取上清液于100 000×g、4 ℃離心，用提膜緩沖液[50 mmol/L 2- （N-嗎啉代）乙磺酸（MES，pH 6.5）、30%甘油]重懸沉淀，使之成為均一溶液即得到含Mistic-ALG3 及其突變蛋白的大腸埃希菌菌膜成分[19]。

1.3.4 Western blotting 檢測 取合適濃度的蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合煮5 min，高速離心5 ～10 min 后取上清液上樣于12% SDS-PAGE 凝膠，200 V 恒壓電泳1 h。電泳結(jié)束后半干法轉(zhuǎn)膜，封閉1 h 后加入一抗（抗His 標(biāo)簽）（1:2 000），室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次后加入二抗（1:5 000），室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，最后用化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.3.5 Mistic-ALG3 突變蛋白活性的測定 ①底物受體Phytanyl-PP-GlcNAc2-Man5（PP-Gn2-M5）的制備[21]：以Phytanyl-PP-GlcNAc2（PP-Gn2）為底物受體，GDP-Man為糖基供體，用純化的Alg1ΔTM、含有TRX-Alg2 的大腸埃希菌菌膜和純化的Alg11ΔTM 進(jìn)行催化。反應(yīng)體系：PP-Gn2（50 μmol/L）、GDP-Man（2 mmol/L）、Alg1ΔTM（80 ng/mL）、含有TRX-Alg2 的大腸埃希菌菌膜（200 μg/mL）、反應(yīng)緩沖液40 μL，30 ℃靜止反應(yīng)12 h 后，加入純化的Alg11ΔTM（100 μg/mL），繼續(xù)在30 ℃靜止反應(yīng)12 h，得到ALG3 的反應(yīng)底物PP-Gn2-M5。② 糖基供體Phytanyl-Phosphate-Mannose（Phy-P-Man）的制備[19]：以Phytanyl-Phosphate（Phy-P）為底物受體，GDP-Man 為糖基供體，用含有長萜基磷酸-甘露糖轉(zhuǎn)移酶多肽1（dohchylphosphate mannosyltransferase polypepfide 1，DPM1） 的大腸埃希菌菌膜進(jìn)行催化。反應(yīng)體系：50 mmol/L Tris/HCl（pH 7.5）、10 mmol/L MgCl2、1% NP-40、20 mmol/L Phy-P、50 mmol/L GDP-Man、含有DPM1 的大腸埃希菌菌膜（100 mg/mL），30 ℃靜止反應(yīng)12 h 后，用薄層色譜（TLC）檢測Phy-P 是否完全轉(zhuǎn)化為Phy-P-Man。③Mistic-ALG3 及突變蛋白的酶活測試：以PP-Gn2-M5 為底物受體，Phy-P-Man 為糖基供體，提取含有Mistic-ALG3或突變蛋白的大腸埃希菌菌膜進(jìn)行催化反應(yīng)。反應(yīng)體系：在生成PP-Gn2-M5 的體系中加入2 mmol/L Phy-P-Man、10 mmol/L MnCl2、含Mistic-ALG3 或突變蛋白（20 mg/mL） 的大腸埃希菌菌膜，30 ℃靜止反應(yīng)20 h。

1.3.6 糖鏈的純化 參照文獻(xiàn)[19,21]的方法，在酶活測試的反應(yīng)體系中加入40 mmol/L HCl 300 μL，100 ℃ 1 h 終止反應(yīng)。用1 mL 固相萃取柱純化糖鏈，步驟如下：分別用甲醇4 mL、100%乙腈4 mL、50%乙腈4 mL、2%乙腈10 mL 平衡柱子；取2%乙腈0.7 mL 加入到反應(yīng)體系中震蕩混合均勻，高速離心1 min，取上清液上樣于固相萃取柱，重復(fù)該步驟1 次；之后用2%乙腈15 mL 分3 次洗脫雜質(zhì)；最后用1.4 mL 30%乙腈洗脫得到目的糖鏈，收集到的溶液經(jīng)真空冷凍干燥后，加入40 μL 去離子水溶解。

1.3.7 LC-MS 檢測條件 采用LC-MS 的方法檢測產(chǎn)物糖鏈[20]，其中流動相A 為乙腈、B 為超純水，使用超高效液相色譜酰胺柱分離，柱溫40 ℃。液相條件為：0 ～2 min，20% B；2 ～15 min，20%～50% B；15 ～18 min，50% B。 流速為0.2 mL/min。質(zhì)譜條件為陽離子模式，質(zhì)荷比（m/z） 檢測范圍為400 ～2 000。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料用±s 表示，將7 位患者按照存活時間分為小于1 年組和大于1 年組，比較2 組突變蛋白酶活性，組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌表達(dá)的釀酒酵母來源重組Mistic-ALG3 的活性定量檢測

首先用化學(xué)-酶法合成DP-Gn2-M5 類似物PP-Gn2-M5和Dol-P-Man 類似物Phy-P-Man，再在大腸埃希菌表達(dá)釀酒酵母Mistic-ALG3，利用其在體外催化反應(yīng)生成Phytanyl-PP-GlcNAc2-Man6（PP-Gn2-M6）；同時以僅轉(zhuǎn)化了空質(zhì)粒pET28a 的菌株（空載質(zhì)粒）作為對照。反應(yīng)結(jié)束后，采用LC-MS 的方法檢測產(chǎn)物，定量分析酶活性。由圖2 可知，加入表達(dá)Mistic-ALG3 的大腸埃希菌菌膜的樣品出峰時間為15.2 min 和15.3 min，對應(yīng)的質(zhì)荷比為1 419.57，指示反應(yīng)生成的產(chǎn)物為Gn2-M6；而加入空載質(zhì)粒的樣品出峰時間為14.5 min 和14.6 min，對應(yīng)的質(zhì)荷比為1 257.48，指示仍為反應(yīng)底物Gn2-M5。

圖2 釀酒酵母重組Mistic-ALG3 的活性分析Fig 2 Activity analysis of recombinant yeast Mistic-ALG3

2.2 ALG3-CDG 患者對應(yīng)重組釀酒酵母ALG3 突變蛋白的原核表達(dá)

構(gòu)建的6 個ALG3 突變的大腸埃希菌表達(dá)載體，經(jīng)過測序驗證后，分別轉(zhuǎn)化到Rosetta（DE3）菌株誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后提取大腸埃希菌菌膜成分，通過Western blotting 確認(rèn)蛋白的表達(dá)。結(jié)果（圖3）顯示，上述6 個突變蛋白在大腸埃希菌體系中的表達(dá)量與野生型（wild type，WT）ALG3 蛋白基本一致。

圖3 酵母Mistic-ALG3 突變蛋白的原核表達(dá)Fig 3 Prokaryotic expression of yeast Mistic-ALG3 mutants

2.3 定量分析6 個突變蛋白的相對活性

通過LC-MS 對6 個突變體的活性進(jìn)行測定，并與野生型ALG3 比較，計算突變蛋白的相對活性。結(jié)果（圖4） 顯示，I70T 突變蛋白相對活性為2.8%，Y72R 突變蛋白相對活性為4.9%，G98R 突變蛋白相對活性為4.5%，L157K突變蛋白相對活性為17.2%，R171Q 突變蛋白相對活性為4.8%，M221T 突變蛋白相對活性為22.3%。

圖4 酵母Mistic-ALG3 突變蛋白的活性分析Fig 4 Activity analysis of yeast Mistic-ALG3 mutants

2.4 突變蛋白活性與患者臨床特征分析

將突變蛋白的相對活性與ALG3-CDG 患者的臨床特征匯總后，結(jié)果見表2。生存時間較長的患者均為雜合突變，且至少有1 個突變蛋白保留了一定的酶活性。將7 位患者按照存活時間分為小于1 年和大于1 年2 組，雜合突變患者以較高的酶活性為準(zhǔn)，比較發(fā)現(xiàn)生存期大于1 年患者對應(yīng)的突變蛋白活性顯著高于小于1 年的患者（圖5，P=0.002）。

表2 ALG3-CDG 患者突變位點與酵母對應(yīng)Mistic-ALG3 突變蛋白的活性Tab 2 Mutation sites of ALG3-CDG patients and relative activity of conserved yeast Mistic-ALG3 mutants

Continued Tab

圖5 不同生存期患者對應(yīng)突變蛋白活性的比較Fig 5 Comparison of activities of corresponding mutations between the patients with different survival periods

3 討論

真核生物ALG3 的天然底物中含有多萜醇（dolichol）結(jié)構(gòu)，但多萜醇水溶性差且不易大量制備[23]，因此本實驗室前期研究中以化學(xué)-酶法制備了ALG3 底物類似物PPGn2-M5 和糖基供體類似物Phy-P-Man，并在大腸埃希菌體系表達(dá)了釀酒酵母重組Mistic-ALG3 蛋白，利用含有該蛋白的大腸埃希菌菌膜成分催化生成PP-Gn2-M6[19-21]。Mistic-ALG3 屬于多次跨膜蛋白，純化極其困難；而大腸埃希菌沒有DLO 合成途徑，也沒有與ALG3 功能相似的同源蛋白，因此直接利用含有Mistic-ALG3 重組蛋白的大腸埃希菌膜成分催化反應(yīng)是可行的[20]。在本研究中，參照上述反應(yīng)體系，定量檢測釀酒酵母重組Mistic-ALG3 的活性，結(jié)果確認(rèn)了大腸埃希菌表達(dá)體系得到的釀酒酵母重組Mistic-ALG3 具備較高的反應(yīng)活性。

本研究進(jìn)而對ALG3-CDG 相關(guān)的酵母保守性Mistic-ALG3 突變蛋白的活性進(jìn)行了研究。首先確認(rèn)了6 個ALG3-CDG 相關(guān)酵母重組ALG3 突變蛋白在大腸埃希菌體系中蛋白表達(dá)量與野生型基本一致，因此在測量它們的活性時，反應(yīng)中加入相同的總蛋白量即可對突變體和野生型蛋白進(jìn)行相對活性的比較。

將本研究LC-MS 定量檢測的突變蛋白相對活性與文獻(xiàn)報道的ALG3-CDG 患者臨床特征匯總后發(fā)現(xiàn)：患者1[4]、 患者6 和患者7[9]為純合子突變，即患者ALG3 基因所在的2 條染色體有相同的突變位點。患者1 的突變?yōu)镽171Q，測得其對應(yīng)的釀酒酵母突變蛋白R171Q 的相對活性僅為4.8%；患者6 和7 的突變?yōu)镚96R，測得其對應(yīng)的釀酒酵母突變蛋白G98R 的相對活性僅為4.5%，均與3位患者較短的生存期相吻合[9]。

患者2、患者3[5]、患者4 和患者5[8]為復(fù)合雜合子突變，即患者ALG3 基因所在的2 條染色體上具有不同突變，疾病嚴(yán)重程度往往受活性高的突變體影響較大?；颊? 和患者3 的突變位點相同，為W71R 和M157K，測得其對應(yīng)的釀酒酵母突變蛋白Y72R 的相對活性為4.9%，而L157K 的相對活性為17.2%；同樣地，患者4 和患者5 的突變位點相同，為I69T 和M209T，測得其對應(yīng)的釀酒酵母突變蛋白I70T 的相對活性為2.8%，而M221T 的相對活性為22.3%。因4 位患者均有一條染色體上的突變位點對應(yīng)的ALG3 蛋白保留了一定的活性，在報道[5,8]時均依然存活，為7 ～21 歲[8]。

綜上所述，本研究為后續(xù)ALG3-CDG 診斷方法及疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測提供了理論依據(jù)。

參·考·文·獻(xiàn)

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