袁 源， 陳海杰， 蒲海欽， 李 根

(1.西南冶金地質(zhì)測試中心，四川成都 611730； 2.中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所，河北廊坊 065000)

硒是參與人體組織代謝過程，維持人體正常生理功能的必需微量元素之一[1]。醫(yī)學(xué)上經(jīng)過大量實驗證明其具有防癌、提高人體免疫力、預(yù)防心腦血管疾病等生理功能[2]。鍺雖然不是人體必需的微量元素，但研究表明有機(jī)鍺中的Ge -132對調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、抗高血壓、養(yǎng)顏美容等方面具有一定的作用[2]。但是任何元素攝入過量都會對人體健康造成不利影響，硒和鍺也不例外。通過食用植物源性食品是人體攝取硒和鍺的主要途徑，因此，測定植物中的硒和鍺含量對于發(fā)現(xiàn)和篩選富硒富鍺植物具有現(xiàn)實意義。

測定植物樣品中硒和鍺總量的方法主要有氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法[3 - 8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9 - 11]、電化學(xué)方法[12,13]、分子光譜法[14]等。氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法具有操作簡單、線性范圍較寬、檢出限低、選擇性好、儀器價格低廉等優(yōu)點(diǎn)。在實際分析測試中，由于只有四價硒能夠與KBH4反應(yīng)生成氫化物，原子熒光光譜法中常采用HCl作為預(yù)還原劑還原高價硒為四價硒。另一方面，鍺的氯化物極易揮發(fā)，曾有學(xué)者利用四氯化鍺這一特性達(dá)到將鍺從樣品基體中分離的目的[15]。目前，文獻(xiàn)報道的原子熒光光譜方法中大多數(shù)都是對植物樣品中的硒和鍺分別進(jìn)行測定，且很少對方法技術(shù)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)評價。食品檢測國家標(biāo)準(zhǔn)方法[16,17]對硒鍺也是進(jìn)行單元素測定。本方法采用微波消解處理植物源性食品樣品，硫脲預(yù)還原硒，氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法同時測定痕量硒和鍺，并采用國家一級生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)考察方法的諸多技術(shù)參數(shù)，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范對參數(shù)進(jìn)行評價。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

AFS -8520型雙道原子熒光光譜儀(北京海光儀器有限公司)；硒、鍺高強(qiáng)度空心陰極燈，型號均為HAF-2(北京有色金屬研究總院)；MARS5型微波消解儀(美國，CEM公司)；VB24 UP型趕酸儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)。

硒、鍺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 mg/mL(美國SPEX CertiPrep公司)。硒、鍺標(biāo)準(zhǔn)工作液：將硒和鍺標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別逐級稀釋至0.1 μg/mL；還原劑(2%KBH4溶液)：稱取20 g KBH4溶于1 L KOH溶液(5 g/L)中，現(xiàn)配現(xiàn)用；預(yù)還原劑(2%硫脲溶液)：稱取2 g硫脲，用去離子水定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；HNO3(北京化學(xué)試劑研究所)為MOS級，H3PO4、H2O2、KBH4、硫脲等(成都金山化學(xué)試劑有限公司)為優(yōu)級純。實驗用水為去離子水(電阻率18.1 MΩ·cm)。

1.2 校準(zhǔn)曲線的建立

分別移取0.1 μg/mL硒、鍺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于50 mL容量瓶中，依次加入5.0 mL預(yù)還原劑(2%硫脲)，5.0 mL H3PO4，用去離子水定容搖勻。此混合標(biāo)準(zhǔn)系列的硒、鍺濃度均為0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 ng/mL，然后按擬定儀器工作參數(shù)進(jìn)行測定并制作校準(zhǔn)曲線。

1.3 實驗樣品

實驗用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為國家一級生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10021豆角、GBW10023紫菜、GBW10048芹菜、GBW10052綠茶)(中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所)；實驗用植物樣品為市售農(nóng)產(chǎn)品，品種分別為韭菜、大蔥、豌豆、菠菜。樣品經(jīng)洗凈、晾干、剪切后在溫度70 ℃條件下通風(fēng)干燥48 h，采用瑪瑙研缽手工研磨，使樣品全部通過50目(0.3 mm)尼龍篩，并混合均勻，制成待測試樣。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5000 g樣品于微波消解內(nèi)罐中，加入6.0 mL HNO3，1.0 mL H2O2，加蓋靜置過夜。次日放入微波消解儀中，設(shè)置微波消解程序進(jìn)行消解。消解完成后，冷卻至室溫開蓋，將消解罐置于趕酸儀中100 ℃趕酸至約0.5 mL以下小體積，用少量去離子水將消解液洗滌轉(zhuǎn)入10 mL比色管中，依次加入2%硫脲溶液1.0 mL，H3PO41.0 mL，用去離子水定容至10 mL，搖勻待測。同時做方法空白試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波消解程序

實驗所用微波消解儀具有比例溫度/時間控制(Ramp to Temperature)模式，可根據(jù)設(shè)定目標(biāo)溫度和樣品消解罐數(shù)量，自動調(diào)整微波輻射功率，使消解反應(yīng)勻速升溫并控制在所設(shè)定目標(biāo)溫度。因此僅需對升溫速率、目標(biāo)溫度、保溫時間進(jìn)行優(yōu)化。實驗在參考微波消解儀推薦植物樣消解條件的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次實驗確定按表1的微波消解程序進(jìn)行3步消化，可以充分破壞樣品中的有機(jī)物，使其完全消解。

表1 微波消解程序Table 1 Operating program of the microwave digestion system

2.2 儀器工作參數(shù)

由于原子熒光光譜儀各儀器參數(shù)對熒光強(qiáng)度的影響相對獨(dú)立，且各參數(shù)之間沒有相互影響，因此本實驗采用單因素試驗設(shè)計方法來確定最優(yōu)儀器工作條件。考察了光電倍增管負(fù)高壓、空心陰極燈燈電流、原子化器高度、載氣流量、屏蔽氣流量對同時測定硒和鍺的影響，使用硒鍺含量均為2 ng/mL的溶液上機(jī)測試。隨著負(fù)高壓的增大，信號與噪聲水平同時增加，但過高的負(fù)高壓會造成信噪比的下降，使短期穩(wěn)定性變差；燈電流的增大使靈敏度逐漸提高，但燈電流達(dá)到一定值時譜線會變寬，可能產(chǎn)生自吸現(xiàn)象，且高燈電流會影響燈的使用壽命；原子化器高度(即火焰高度)影響待測元素的原子化效率，對于硒鍺需將火焰的正上部對準(zhǔn)光電倍增管入光口，實驗中高度在5～9 mm范圍內(nèi)硒鍺的熒光強(qiáng)度較穩(wěn)定；載氣流量對硒鍺的熒光強(qiáng)度影響較大，載氣流量小，氬氫火焰變小，熒光信號低，載氣流量大，原子蒸氣被過度稀釋，也會造成熒光信號降低；屏蔽氣的主要作用是防止空氣進(jìn)入火焰，當(dāng)熒光強(qiáng)度穩(wěn)定后，其流量對熒光強(qiáng)度沒有顯著影響。最終確定的原子熒光光譜儀同時測定硒和鍺的儀器參數(shù)見表2。

表2 儀器工作參數(shù)Table 2 Operating parameters of instrument

圖1 磷酸濃度對硒鍺熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of H3PO4 concentration on fluorescence intensity of Se and Ge

2.3 測定介質(zhì)及濃度

實驗考察了H3PO4、HNO3、H2SO4三種酸介質(zhì)(體積百分濃度均為5%)對硒鍺同時測定的影響。使用硒鍺濃度均為2 ng/mL的溶液上機(jī)測試，結(jié)果表明對于硒的熒光強(qiáng)度，HNO3介質(zhì)最高；對于鍺的熒光強(qiáng)度，H3PO4介質(zhì)明顯高于其他介質(zhì)，這可能是由于H3PO4的存在有利于鍺氫化物生成的化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)過程[18]。兼顧硒和鍺的原子熒光強(qiáng)度，實驗選擇H3PO4作為測定介質(zhì)并進(jìn)一步考察其濃度的影響，結(jié)果見圖1。H3PO4濃度低于2%時硒和鍺的氫化物生成反應(yīng)進(jìn)行緩慢，熒光強(qiáng)度低，在2%～6%之間時，硒的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定，高于6%時呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；H3PO4濃度在2%～20%之間時，鍺的熒光強(qiáng)度較高且相對穩(wěn)定。綜合考慮二者的最佳酸度區(qū)間，選擇5%H3PO4作為測定介質(zhì)。

2.4 預(yù)還原劑及用量

圖2 硫脲濃度對硒鍺熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of thiourea concentration on fluorescence intensity of Se and Ge

消解后的樣品有部分硒會以高價的形態(tài)存在，由于只有四價硒能夠與KBH4反應(yīng)生成氫化物，所以需要進(jìn)行預(yù)還原處理將高價硒還原為四價硒，實驗采用硫脲作為預(yù)還原劑并考察其用量對硒鍺同時測定的影響。吸取硒、鍺濃度均為20 ng/mL的溶液1 mL，按照1.4的方法處理，當(dāng)其他條件不變的情況下，僅改變2%硫脲溶液的加入量，定容至10 mL，放置3 h后上機(jī)測試，結(jié)果如圖2所示。在酸性介質(zhì)中，硫脲的存在起到了還原高價硒的作用，但隨著硫脲濃度的繼續(xù)增加，硒熒光強(qiáng)度會逐漸降低，這可能是由于高濃度硫脲繼續(xù)還原四價硒為零價硒，嚴(yán)重影響硒氫化物產(chǎn)率；硫脲對鍺的熒光強(qiáng)度影響較小。綜上，實驗最終選擇較低硫脲濃度0.2%。

2.5 KBH4用量

還原劑KBH4濃度對硒和鍺氫化物生成的反應(yīng)速率以及氬氫火焰的穩(wěn)定性有很大的影響。實驗使用硒鍺濃度均為2 ng/mL的溶液上機(jī)測試，其他條件保持不變，僅改變KBH4的濃度。結(jié)果表明，KBH4濃度過低會造成反應(yīng)不完全，熒光強(qiáng)度降低；KBH4濃度過高會使反應(yīng)生成過量的氫氣，稀釋硒鍺氫化物在氣相的濃度，使熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性變得極差。濃度在1.5%～3%之間時，硒和鍺的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且信號相對穩(wěn)定。實驗選擇KBH4濃度為2%。

2.6 共存元素干擾試驗

氫化物發(fā)生原子熒光光譜分析方法中共存元素的干擾主要分為由過渡金屬元素對氫化物發(fā)生過程的動力學(xué)液相干擾，以及由可形成氫化物元素之間在傳輸及原子化過程中的氣相干擾。實驗配制硒鍺濃度均為10 ng/mL的溶液，通過加入不同濃度的過渡金屬元素或可形成氫化物元素上機(jī)測試。結(jié)果顯示，對于硒的測定，10 000倍的鐵，3 000倍的鋅，1 000倍的錳、銅和鉛，500倍的砷和銻，300倍的鈷、鎳和錫均不產(chǎn)生干擾；對于鍺的測定，15 000倍的鐵，5 000倍的鋅，2 000倍的鉛，1 000倍的錳和銅，300倍的砷、銻和錫，200倍的鈷和鎳均不產(chǎn)生干擾。此外，對硒和鍺之間的相互干擾進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：300倍的鍺對硒的測定不產(chǎn)生干擾；1 000倍的硒對鍺的測定不產(chǎn)生干擾。

2.7 校準(zhǔn)曲線線性范圍

實驗以硒、鍺濃度在0.5～200 ng/mL范圍繪制校準(zhǔn)曲線，采用普通最小二乘法線性擬合，考察本方法條件下實驗所用原子熒光光譜儀的線性響應(yīng)范圍。結(jié)果表明，硒在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9993；鍺在0.5～20 ng/mL范圍內(nèi)濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9989。

2.8 方法檢出限和定量限

按照本文方法,對11份全程序空白溶液進(jìn)行測定并計算測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，用3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的濃度和稀釋因子(稱樣量、定容體積)計算方法檢出限(MDL),硒和鍺分別為：0.0015、0.0038 mg/kg；按3倍方法檢出限計算方法定量限(MQL)，硒和鍺分別為：0.0045、0.011 mg/kg。

2.9 方法精密度

選取國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW10023紫菜、GBW10052綠茶，按照本文方法平行處理10份樣品并測試，計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明：對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10023，10次測量其硒、鍺平均值分別為0.117、0.057 mg/kg,其精密度(RSD)分別為4.9%、6.3%。對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10052，硒、鍺10次測量的平均值分別為0.111、0.016 mg/kg,RSD分別為6.5%、10.7%。

2.10 方法準(zhǔn)確度

采用本方法對國家一級生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW10021、GBW10023、GBW10048、GBW10052中的硒和鍺進(jìn)行同時測定并計算測定結(jié)果相對誤差(RE)，結(jié)果見表3。

表3 方法準(zhǔn)確度Table 3 Accuracy of the method

2.11 方法技術(shù)參數(shù)評價

本方法采用國家一級有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實施了檢測結(jié)果的量值溯源，在此基礎(chǔ)上對方法的主要技術(shù)參數(shù)進(jìn)行評價。需要說明的是，原子熒光光譜法同時測定硒和鍺未列入任何現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法,并且硒和鍺既不屬于食品中禁用物質(zhì)也不屬于有最高殘留限量規(guī)定的元素，在食品檢測標(biāo)準(zhǔn)中未見對兩元素檢測方法全面完整的技術(shù)規(guī)定。因此，技術(shù)參數(shù)的評價綜合參考了以下幾個最相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。其中，方法檢出限評價參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.93-2017)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測定》和(GB/T 5009.151-2003)《食品中鍺的測定》中原子熒光光譜法的建議方法檢出限(換算成本法稀釋因子)，精密度評價參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27404-2008)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中對不同含量水平樣品檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)的要求，準(zhǔn)確度評價參考2017年當(dāng)時的環(huán)境保護(hù)部聯(lián)合多部委發(fā)布的環(huán)辦土壤函1332號《農(nóng)用地土壤污染狀況詳查質(zhì)量保證與質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)定(發(fā)布稿)》中對植物農(nóng)產(chǎn)品微量痕量元素檢測相對誤差(RE)的要求。評價結(jié)果如表4所示，方法檢出限低于標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的單元素測定檢出限，說明本方法所用的原子熒光光譜儀滿足同時測定的要求；RSD在兩種數(shù)量級水平上低于標(biāo)準(zhǔn)控制限，方法有較為優(yōu)良的精密度；RE在兩種含量范圍內(nèi)均低于規(guī)范控制限，方法準(zhǔn)確度良好。

表4 方法技術(shù)參數(shù)評價Table 4 Assessment of the method technical parameter

2.12 實際樣品分析

采用本方法對市售植物樣品進(jìn)行分析，每個樣品進(jìn)行5次平行分析取平均值作為測定結(jié)果計算樣品中硒和鍺含量，結(jié)果見表5。本次采樣中豌豆的硒含量最高，大蔥的鍺含量最高。

表5 樣品分析Table 5 Analysis of samples

3 結(jié)論

應(yīng)用本方法同時測定植物源性食品中的硒和鍺，分析成本低廉，提高了工作效率，取得了滿意的效果。但是，相較于電感耦合等離子質(zhì)譜法的超寬線性范圍(達(dá)7個數(shù)量級以上)，本方法中使用的原子熒光光譜儀同時測定硒和鍺分別只有3個和2個數(shù)量級的線性范圍，這就限制了本法對硒鍺含量差異較大的樣品的同時測定。結(jié)合方法定量限，本法硒和鍺的測定范圍分別為0.0045～2.0 mg/kg和0.011～0.40 mg/kg。