樂 淵*， 劉春華， 尹桂豪， 王明月

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全 重點實驗室，海南?？?571101)

氟唑菌酰胺是一種新型吡唑類殺菌劑，通過抑制病原菌內(nèi)琥珀酸脫氫酶活性，阻礙呼吸作用，從而抑制病原菌的生長，具有高效、廣譜、選擇性好、持效久等特性[1,2]。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過抑制線粒體呼吸阻止細(xì)胞色素合成來殺傷病原菌[3]。氟唑菌酰胺與吡唑醚菌酯的復(fù)配藥劑常用來防治蔬菜水果中的白粉病、灰霉病、炭疽病等，也可用于防治香蕉黑星病和葉斑病等病害[4 - 6]。隨著殺菌劑使用的日益廣泛，其在果實中的殘留狀況也開始受到密切關(guān)注。國際食品法典委員會已制定氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在香蕉中的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為3 mg/kg和0.02 mg/kg，我國也規(guī)定吡唑醚菌酯在香蕉中的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.02 mg/kg[7]。因此，有必要開展香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的分析方法研究，為它們的使用、監(jiān)管提供技術(shù)依據(jù)。

QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe)方法因其快速、簡便、適用范圍廣等特點，成為果蔬中農(nóng)藥殘留分析中最常用的前處理方法[8]。N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)和石墨化炭黑(GCB)等是QuEChERS方法中最常用的吸附材料，但它們的凈化效果時常令人不太滿意[9]。目前新型吸附材料成為改良QuEChERS方法的研究熱點。多壁碳納米管(MWCNTs)憑借比表面積大、吸附性能好等優(yōu)點受到研究者的關(guān)注，并被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域[10,11]。將MWCNTs和無水MgSO4粉末裝入針式過濾器中，采用抽提式凈化方式，相比傳統(tǒng)QuEChERS方法采用的離心分離更節(jié)省時間[12]。本研究擬采用MWCNTs濾過型凈化的前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法的可分析農(nóng)藥范圍廣、靈敏度高和選擇性好等特點，建立了測定香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留量的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TripleQuad 4500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)(美國，AB SCIEX公司)；ACQUITY UPLC液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器(美國，WATERS公司)；VS-24SMTi型高速冷凍離心機(美國，VISION公司)；MJ-PB12Power304型破壁機(美的公司)。

氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1 000 mg/L(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，美國Fisher公司)；N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑、十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑、石墨化炭黑(GCB)吸附劑(美國Agilent公司)；MWCNTs濾過型凈化柱(m-PFC，天津博納艾杰爾科技有限公司)，內(nèi)有10 mg MWCNTs(外徑10～20 nm，內(nèi)徑5 nm，長度5～15 μm)和150 mg無水MgSO4；無水MgSO4、NaCl、NaAc、HAc(廣州化學(xué)試劑廠)；二水檸檬酸鈉和檸檬酸二鈉鹽倍半水合物(上海阿拉丁公司)。實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)0.22 μm過濾膜過濾的純化水。

香蕉樣品購自本地超市和水果批發(fā)市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取1 mL氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成濃度為100 mg/L的2種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-18 ℃冰箱。然后用乙腈進(jìn)行逐級稀釋，配制成濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取空白香蕉樣品按1.3方法進(jìn)行前處理，得到空白香蕉基質(zhì)溶液。取0.5 mL凈化，氮吹至近干后，用0.5 mL相應(yīng)濃度乙腈配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定容，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

香蕉樣品(分為全蕉和蕉肉兩份)用破壁機攪碎，裝入潔凈容器內(nèi)，作為試樣密封并于-18 ℃下保存。準(zhǔn)確稱取10.00 g均質(zhì)試樣于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈、4.0 g無水MgSO4、1.0 g NaCl和1粒陶瓷均質(zhì)子，劇烈振搖1 min。然后以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液1.00 mL于2 mL離心管中，待凈化。將2.5 mL注射器與多壁碳納米管濾過型凈化柱(m-PFC)連接，向上抽，使所有待凈化液經(jīng)過凈化柱，再推出至離心管中，樣品提取液第二次經(jīng)過吸附劑部分，重復(fù)操作1次。凈化后的提取液經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器工作條件

TripleQuad 4500色譜條件：ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters公司)；流動相：A為含5 mmol/L NH4Ac溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～0.50 min，10%B；0.50～3.00 min，10%～95%B；3.00～5.00 min，95%B；5.00～5.01 min，95%～10%B；5.01～6.00 min，10%B。流速：0.25 mL/min。柱溫：35 ℃；樣品室溫度：15 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL。

TripleQuad 4500質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子掃描；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；溫度：550 ℃；氣簾氣：氮氣，206.8 kPa；噴霧氣：氮氣，379.2 kPa；輔助加熱氣：氮氣，379.2 kPa；碰撞氣：氮氣，55.2 kPa。MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM分析的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters under MRM mode

ACQUITY UPLC液相色譜儀條件：ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters公司)；流動相：A為含5 mmol/L NH4Ac溶液，B為乙腈/甲醇=3/1(體積比)；梯度洗脫程序：0～0.50 min，75%B；0.50～2.50 min，75%～99%B；2.50～8.00 min，99%B；8.00～9.00 min，99%～75%B；9.01～10.00 min，75%B。流速：0.25 mL/min。柱溫：35 ℃；樣品室溫度：20 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL；二極管陣列檢測器檢測波長：450 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS工作條件的優(yōu)化

在電噴霧電離模式下，以直接進(jìn)樣方式分別對1.0 mg/L氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定分子離子峰，并對其子離子進(jìn)行全掃描，每個化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對。其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對，另一對作為定性離子對。隨后進(jìn)行其他質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，結(jié)果見表1。在優(yōu)化質(zhì)譜條件下，分別試驗了甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L NH4Ac溶液、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L NH4Ac溶液和乙腈-水6種流動相體系。結(jié)果表明，以甲醇和含5 mmol/L NH4Ac溶液作為流動相時，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的響應(yīng)值最大，并且可獲得較好的分離度。實驗采用甲醇-5 mmol/L NH4Ac溶液作為流動相。圖1為MRM模式下標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖。

2.2 提取條件的選擇

為改善一些對pH值較為敏感農(nóng)藥的檢測，QuEChERS法常在提取試劑中加入乙酸鹽緩沖體系或檸檬酸鹽緩沖體系[13，14]。本實驗嘗試了在提取過程中加入上述兩種緩沖鹽體系，與不添加緩沖鹽的純乙腈溶液進(jìn)行提取效果比較。添加水平為50 μg/kg，按文獻(xiàn)方法[13,14]和1.3節(jié)操作。結(jié)果顯示3種條件下，吡唑醚菌酯的提取效率分別為84.4%、91.5%和102%。實驗選擇純乙腈作為提取溶劑，不添加緩沖鹽。

圖2 四種條件凈化香蕉提取液的超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器(PDA)色譜圖Fig.2 UPLC-PDA chromatograms showing removal of pigments from banana extracts using the four cleanup protocols

2.3 凈化條件的選擇

實驗考察了PSA、C18、GCB和m-PFC對全蕉(顏色比蕉肉更深)乙腈提取液的凈化效果。分別取1 mL全蕉提取液，用4種條件凈化：(1)50 mg PSA+150 mg無水MgSO4；(2)50 mg C18+150 mg無水MgSO4；(3)50 mg GCB+150 mg無水MgSO4：(4)m-PFC(10 mg MWCNTs+150 mg無水MgSO4)。參照文獻(xiàn)[15]對色素凈化效果進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。與PSA和C18相比，m-PFC凈化效果更好，原因可能是MWCNTs比表面積更大，還具有中空結(jié)構(gòu)。因此實驗選擇m-PFC作為凈化條件。

實驗還考察了m-PFC凈化次數(shù)對凈化效果的影響。結(jié)果表明，凈化次數(shù)對氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的回收率影響不大；與凈化1次相比，凈化2次、3次和4次時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，原因可能是凈化次數(shù)增加有利于吸附材料與提取液充分接觸。實驗過程中，凈化第3次和第4次時，凈化柱抽提比較費勁、耗時也較長，原因可能是無水MgSO4遇提取液中微量水份后結(jié)塊，導(dǎo)致柱壓升高。綜合考慮，實驗選擇凈化2次。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

移取一定量的氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白全蕉和蕉肉基質(zhì)提取液為稀釋溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用1.4中方法進(jìn)行測定，以儀器響應(yīng)峰面積對目標(biāo)物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的質(zhì)量濃度在0.005～0.2 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2。以滿足方法學(xué)要求的最低添加回收水平作為定量限(LOQ)，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在全蕉和蕉肉中的定量限均為5 μg/kg。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

本文通過測定氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液中校正曲線的斜率(A)及其在乙腈標(biāo)準(zhǔn)工作液中校正曲線的斜率(B)，得到基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(A-B)/B×100%。若ME>0，表示基質(zhì)增強效應(yīng)；若ME<0，表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。表3為氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在全蕉和蕉肉中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯在全蕉和蕉肉中均表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域，常采用使用分析保護(hù)試劑、標(biāo)準(zhǔn)加入法、同位素內(nèi)標(biāo)法、樣品稀釋和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液等消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響[16 - 18]。由于空白基質(zhì)相對容易獲取，本實驗采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行定量分析來提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.6 方法的精密度和回收率

取空白全蕉和蕉肉樣品，按5、10、50 μg/kg 3個水平進(jìn)行加標(biāo)實驗，按1.3方法進(jìn)行前處理，每個平行測定6次，作回收率和精密度實驗。結(jié)果(表3)顯示，氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的平均回收率在74.7%～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.1%～8.2%之間，滿足農(nóng)藥殘留分析方法要求[19]。

表3 方法平均回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)及基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Average recovery,relative standard deviation(n=6) and matrix effect of the method

2.7 實際樣品的測定

采用本實驗建立的方法測定了3個超市和1個水果批發(fā)市場的16份香蕉樣品，其中1份全蕉樣品檢出氟唑菌酰胺，含量為0.087 mg/kg；1份全蕉樣品檢出吡唑醚菌酯，含量為0.015 mg/kg。檢測結(jié)果均低于國際食品法典委員會和我國限量標(biāo)準(zhǔn)。相應(yīng)的蕉肉樣品中未檢出氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯。其余樣品均未檢出氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時分析香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留量的方法。采用多壁碳納米管濾過型凈化柱凈化，具有比PSA、C18和GCB等吸附材料更好的凈化效果。通過優(yōu)化儀器條件、提取條件和凈化條件等，實現(xiàn)了氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯的有效提取、凈化和色譜分離。方法學(xué)考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、凈化效果好和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，可用于香蕉中氟唑菌酰胺和吡唑醚菌酯殘留量的快速檢測，具有一定的推廣價值。