張 劍，弓志青，王文亮，羅金華，鄧利玲

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南 250100；2. 重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶 400222）

硒是人體必需的微量元素之一，具有提高人體免疫力、預(yù)防多種疾病等生理功能[1]。攝入不足會引起克山病、大骨節(jié)病等，過量攝入會引起關(guān)節(jié)痛、腹瀉、脫發(fā)等癥狀[2]。根據(jù)硒的存在形式可以分為無機硒和有機硒，無機硒主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽形式存在，有機硒主要為硒蛋白、硒代氨基酸、硒多糖等形式。與無機硒相比，有機硒具有更易被機體吸收利用、安全性更高的特點[3]。因此，如何有效地將無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒是目前的研究方向之一。

靈芝是傳統(tǒng)的食藥用菌，含有豐富的營養(yǎng)及功能成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降三高等多種功效[4]。作為硒轉(zhuǎn)化生物載體，靈芝具有耐硒能力強、轉(zhuǎn)化水平高等優(yōu)點[5-6]，其生長周期短、栽培條件可控，因此富硒靈芝具有廣闊的發(fā)展前景。

目前，硒的檢測方法主要有石墨爐原子吸收光譜法[7-8]、X 射線熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、高效液相色譜－原子熒光光譜法等[9]。由于不同物質(zhì)中硒的形態(tài)各異，不同方法均有其優(yōu)勢。同時，硒的安全與毒性劑量的范圍較窄，合理選擇檢測方法才能更加準(zhǔn)確地測定硒的含量，確保富硒產(chǎn)品的營養(yǎng)安全性。

試驗采用氫化物發(fā)生- 原子熒光光譜法測定靈芝孢子粉中的總硒、無機硒，通過差減法計算總有機硒的含量，旨在為富硒靈芝孢子粉硒含量測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L，國家環(huán)境保護總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所提供；硝酸、高氯酸、鹽酸氫氧化鈉、硼氫化鈉，均為分析純；試驗用水為超純水；靈芝孢子粉樣品，重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FA-1004 型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；微波消解儀ETHOS 1、MILESTONE PF32原子熒光光度儀（配硒空心陰極燈），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 總硒的測定

參照GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》，采用氫化物原子熒光光譜法，對檢測條件進行優(yōu)化后測定總硒含量。

PF32 原子熒光光度儀優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 PF32 原子熒光光度儀優(yōu)化參數(shù)

1.3.2 樣品消解方法

采用微波消解方法，稱取靈芝孢子粉0.5 g（精確至0.001 g），置于消化管中，加10 mL 硝酸、2 mL 過氧化氫，振搖混合均勻，于微波消解儀中消化。

微波消解程序見表2。

表2 微波消解程序

消解完成待冷卻后，將消化液轉(zhuǎn)入錐形燒瓶中，在電熱板上（150～180 ℃） 加熱至近干，再加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，冷卻，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加入鐵氰化鉀溶液，用水定容，混勻待測，同時做空白試驗。

1.3.3 無機硒的測定

參照DB 3301/T117—2007《稻米中有機硒和無機硒含量的測定- 原子熒光光譜法》，采用鹽酸水浴的方法對靈芝孢子粉中的無機硒進行提取，使其與有機硒分離，再用1.3.1 中的方法檢測無機硒含量。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取一定量的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，用鹽酸及超純水配置成最高質(zhì)量濃度的硒溶液10.00 μg/L，由原子熒光光度儀自動稀釋成8.00，6.00，4.00，2.00 μg/L，以測得的熒光強度（IF） 為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，通過儀器工作站求出回歸方程、相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 有機硒含量的計算

根據(jù)測得的總硒和無機硒含量，利用差減法計算得出，即有機硒含量=總硒含量- 無機硒含量。

1.3.6 精密度及回收率

稱取1～8 號靈芝孢子粉0.5 g（精確至0.001 g），分別加入含量為0.400，0.200 mg/kg 的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按1.3.1 和1.3.3 中的方法檢測總硒和無機硒含量，計算該方法的總硒、無機硒的加樣回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=64.213X+0.23，其中R2=0.999 5，線性范圍0～10.00 μg/L。按照儀器設(shè)定的檢出限程序，連續(xù)測定樣品空白15 次，得到空白熒光值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差法計算得出檢出限為0.008 μg/L。

2.2 富硒靈芝孢子粉有機硒含量測定

對不同的富硒靈芝孢子粉中的總硒、無機硒進行測量，并計算出有機硒含量。

靈芝孢子粉中不同硒形態(tài)含量及所占比例見表3。

表3 靈芝孢子粉中不同硒形態(tài)含量及所占比例

2.3 精密度與加標(biāo)回收率

各樣品總硒和無機硒回收率見表4。

表4 各樣品總硒和無機硒回收率

由表4 可知，對不同的樣品分別加入不同含量的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定總硒及無機硒含量，得出總硒的回收率為97.50%～103.75%，RSD 為2.44%，無機硒的回收率為97.00%～102.00%，RSD 為1.98%。

3 結(jié)論

采用氫化物原子熒光光譜法結(jié)合鹽酸浸提的方法測定靈芝孢子粉中總硒和無機硒的含量，并用差減法計算出有機硒的含量。結(jié)果表明，靈芝孢子粉中的硒主要是以有機硒形式存在，占比80.00%～93.44%，再次驗證了靈芝是很好的硒轉(zhuǎn)化生物載體。經(jīng)過方法學(xué)驗證，該方法相對準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適合靈芝孢子粉中有機硒含量測定，同時也為其相關(guān)產(chǎn)品有機硒含量的測定提供參考。