黎晗 史云霞 袁弘倫 劉賢青 羅杰

摘 ?要：綠色番茄中的甾體生物堿主要以α-番茄堿（α-tomatine）形式存在，使得果實(shí)帶有苦味而不適宜食用。在果實(shí)成熟過(guò)程中，α-番茄堿會(huì)通過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成七葉皂苷A（esculeoside A），使果實(shí)適宜食用，然而這一代謝途徑尚未被完全解析。本課題組在先前研究中鑒定出一個(gè)參與這一代謝途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶SlERT1b，本研究通過(guò)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究SlERT1b的功能，并利用LC-MS檢測(cè)其中的甾體生物堿，驗(yàn)證該基因可發(fā)揮糖基轉(zhuǎn)移酶的功能。此外，施加外源乙烯和乙烯抑制劑1-MCP后，發(fā)現(xiàn)乙烯可調(diào)控SlERT1b基因，并影響甾體生物堿的合成途徑。同時(shí)鑒定出可以調(diào)控SlERT1b基因的轉(zhuǎn)錄因子SlJERF1和SlAREB2。該研究結(jié)果為今后番茄遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄;甾體生物堿;乙烯;轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946.92 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The steroidal glycoalkaloids in green tomatoes mainly exist in the form of α-tomatine， which gives tomatoes bitter taste and are not suitable for consumption. During the fruit ripening process， α-tomatine will generate esculeoside a through a series of enzymatic reactions， which makes fruits eatable. But the metabolic pathway has not been com-pletely elucidated. In the previous research， we identified a glycosyltransferase SlERT1b which is involved in this met-abolic pathway. In the study， the function of SlERT1b was studied by a tomato genetic transformation experiment. The steroidal glycoalkaloids were detected by LC-MS to verify the role in the metabolic pathway as a glycosyltrans-ferase. Furthermore， the application of exogenous ethylene and ethylene inhibitors 1-MCP could regulate SlERT1b and affect the synthesis of steroidal glycoalkaloids. In addition， we identified the transcription factors SlJERF1 and SlAREB2 which can regulate the expression of SlERT1b. This research provide theoretical basis for the tomato genetic breeding.

Keywords： Solanum lycopersicum; steroidal glycoalkaloids; ethylene; transcription factor

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.010

番茄（Solanum lycopersicum）是一種深受人們喜愛(ài)的蔬菜，其包含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、番茄紅素、β-類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮和植物甾醇等[1-4]。甾體生物堿（SGAs）是一類(lèi)在茄科植物（番茄、馬鈴薯和茄子等）中發(fā)現(xiàn)的特有次生代謝物，又被稱(chēng)為茄堿。甾體生物堿由糖苷配基和糖基側(cè)鏈組成[5]。馬鈴薯中甾體生物堿的主要形式有α-卡茄堿（α-chaconine）和α-茄堿（α-solanine）[6]。在番茄中甾體生物堿主要由2種形式存在，即α-番茄堿（α-tomatine）和脫氫番茄堿（dehydrotomatine），后者的B環(huán)5-6 C-C鍵為雙鍵[7-8]。番茄在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭遇諸多生物脅迫，如真菌、細(xì)菌和昆蟲(chóng)等，甾體生物堿對(duì)這些脅迫具有一定的抗性[9]。甾體生物堿具有與生物膜上的膽固醇結(jié)合進(jìn)而裂解膜結(jié)構(gòu)的生物學(xué)活性，從而使植物獲得抗性[10]。甾體生物堿可以降低人體飲食中的膽固醇[11-12]，另外有研究稱(chēng)α-番茄堿可通過(guò)破壞細(xì)胞膜顯著地抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]。不同于馬鈴薯中的α-卡茄堿和α-茄堿具有強(qiáng)烈毒性[6]，番茄中的α-番茄堿對(duì)人體的毒性較低。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)秘魯存在一種高含量α-番茄堿的番茄品種，在食用后不存在不良反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)番茄的苦味與α-番茄堿的含量呈正相關(guān)[14]。普通番茄在成熟過(guò)程中，α-番茄堿的含量迅速降低，果實(shí)的重量、成熟度和α-番茄堿含量具有顯著的相關(guān)性[15-17]。成熟果實(shí)中的主要甾體生物堿是七葉皂苷A（esculeoside A），由α-番茄堿合成而來(lái)[18-19]。有研究稱(chēng)七葉皂苷A的生物活性可以改善小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化[20]。有研究推測(cè)α-番茄堿到七葉皂苷A的代謝途徑依次為羥化、?；⒘u化和糖基化[21]。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)酮戊二酸雙加氧酶可以參與該過(guò)程的第1步羥化反應(yīng)[22-23]。然而，后續(xù)的代謝途徑受到哪些基因的作用尚未被解析。

研究甾體生物堿合成途徑的調(diào)控關(guān)系對(duì)解析其合成的分子機(jī)理具有重要意義，植物激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝物合成中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，激素通過(guò)影響響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而改變下游基因的表達(dá)。在成熟過(guò)程中，為使種子得以擴(kuò)散，番茄生理、生化和細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的變化影響其外觀、質(zhì)地和風(fēng)味[24]。果實(shí)成熟受乙烯的調(diào)控[25]，包括乙烯依賴(lài)性和非乙烯依賴(lài)性調(diào)控基因同時(shí)發(fā)揮作用，其中乙烯依賴(lài)性基因負(fù)責(zé)番茄紅素和芳香物質(zhì)等的合成[26]。rin是一種番茄成熟突變體，rin基因與乙烯調(diào)控有關(guān)[27]。Picton等[28]從rin突變體差異cDNA文庫(kù)中分離出一些與番茄成熟過(guò)程中代謝途徑密切相關(guān)的成熟特異性基因。乙烯可促進(jìn)成熟番茄中七葉皂苷A的積累[29]，是乙烯可能調(diào)控甾體生物堿合成的一項(xiàng)有力證據(jù)。番茄成熟過(guò)程伴隨著甾體生物堿的變化從而改變其口感，這其中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控值得探索。研究證實(shí)了一個(gè)ERF家族轉(zhuǎn)錄因子GAME9可作用于多個(gè)α-番茄堿的合成基因，因此顯著地調(diào)控甾體生物堿合成途徑[30-31]，但是GAME9僅在植物葉片和未成熟果實(shí)中表達(dá)。番茄成熟過(guò)程中甾體生物堿的種類(lèi)與含量發(fā)生顯著變化，但其受到哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控尚未被發(fā)現(xiàn)，這有待進(jìn)一步解析。

本課題組的前期研究通過(guò)對(duì)番茄的代謝物全基因組關(guān)聯(lián)分析，在10號(hào)染色體上定位到一個(gè)與多個(gè)甾體生物堿含量顯著相關(guān)的位點(diǎn)[32]，并在該位點(diǎn)找到一個(gè)包含7個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶、1個(gè)?；D(zhuǎn)移酶、1個(gè)?；o酶A脫氫酶和1個(gè)細(xì)胞色素p450的基因簇，轉(zhuǎn)錄組分析表明，該基因簇上的基因均在紅果時(shí)期特異表達(dá)[32]。糖基轉(zhuǎn)移酶在甾體生物堿合成中發(fā)揮重要作用[33]。篩選基因簇上所有注釋的糖基轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)關(guān)鍵的候選基因Solyc10g085230，與七葉皂苷A的含量呈顯著相關(guān)。其最初是從rin突變體差異cDNA文庫(kù)中分離出的成熟特異性基因，并命名為SlERT1b[28]。有報(bào)道稱(chēng)SlERT1b的功能可能與果實(shí)成熟密切相關(guān)[28]，本課題組推測(cè)SlERT1b很可能在成熟過(guò)程甾體生物堿的合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究從轉(zhuǎn)基因水平，包括超表達(dá)和RNA干擾基因沉默，解析SlERT1b基因的生物學(xué)功能，并研究乙烯是否影響成熟過(guò)程中的甾體生物堿代謝，以及其中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，為完善番茄果實(shí)中甾體生物堿合成途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料 ?栽培種番茄（Solanum lycoper-sicum cv. MicroTOM）種子購(gòu)自PanAmerican Seed公司（美國(guó)），于2020年秋至2021年春種植于海南大學(xué)熱帶農(nóng)林實(shí)驗(yàn)基地。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種子由本實(shí)驗(yàn)室提供，種植于海南大學(xué)代謝生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)光照培養(yǎng)箱。

1.1.2 ?載體和菌株 ?本研究使用的載體包括Gateway克隆入門(mén)載體pDONR207，植物雙元表達(dá)載體pBI121，植物雙元超表達(dá)載體pK2GW7，植物雙元RNA干擾基因沉默載體pK7GWI?WG （II），酵母單雜交載體pHIS2和pGADT7和煙草LUC轉(zhuǎn)錄激活載體PJG094，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。所用大腸桿菌菌株T1、農(nóng)桿菌菌株GV3101和酵母菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 ?試劑和儀器 ?提取RNA的TransZol試劑和一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ、SacⅠ和T4連接酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司，Gateway克隆體系BP酶和LR酶購(gòu)自賽默飛公司，乙烯利購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，PCR和qPCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，qPCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自諾唯贊公司，酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Frozen-EZ Yeast Transformation II）購(gòu)自ZYMO RESEARCH公司（美國(guó)），雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒（Dual-Luciferase? Reporter Assay System）購(gòu)自Promega公司（美國(guó)）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為賽默飛公司產(chǎn)品型號(hào)為QuantStudio 7 Flex，冷凍干燥機(jī)為CHRIST公司產(chǎn)品型號(hào)為Delta 2-24 LSCplus，代謝物檢測(cè)使用AB SCIEX公司的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器QTRAP 6500+，酶標(biāo)儀為賽默飛公司產(chǎn)品型號(hào)為Varioskan LUX。

1.1.4 ?番茄遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 ?番茄種子萌發(fā)使用T0培養(yǎng)基，為1/2 MS培養(yǎng)基;預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)使用T1培養(yǎng)基，為添加有1 mg/L 6-芐氨基嘌呤和0.1 mg/L吲哚-3-乙酸的MS培養(yǎng)基;配制侵染液首先準(zhǔn)備活化的OD600值約0.5的農(nóng)桿菌，經(jīng)過(guò)4 ℃離心后用添加40 mg/L乙酰丁香酮和2 g/L葡萄糖的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，并稀釋到OD600值為0.1～0.2方可使用;誘導(dǎo)生芽使用T21培養(yǎng)基，為添加有10 mg/L卡納霉素、200 mg/L特美汀、1 mg/L玉米素和0.1 mg/L吲哚-3-乙酸的MS培養(yǎng)基;誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)使用T22培養(yǎng)基，為添加有10 mg/L卡納霉素、200 mg/L特美汀、1 mg/L赤霉素和0.5 mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基;誘導(dǎo)生根使用T3培養(yǎng)基，為添加有5 mg/L卡納霉素、150 mg/L特美汀和2 mg/L吲哚-3-丁酸的1/2 MS培養(yǎng)基。

1.2 ?方法

1.2.1 ?基因克隆和轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建 ?提取MicroTOM番茄紅果組織的RNA，并對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到果肉cDNA用于基因克隆。下載番茄基因的參考序列（https：//solgenomics.net），并使用Oligo 7設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板對(duì)候選基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán);68 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。通過(guò)BP酶連接進(jìn)pDONR207并送擎科公司進(jìn)行測(cè)序。利用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ對(duì)pBI121載體進(jìn)行37 ℃酶切過(guò)夜得到線性化載體，同時(shí)使用帶XbaⅠ和SacⅠ的酶切接頭序列的引物擴(kuò)增適應(yīng)于Gateway體系的attR1-attR2序列，使用T4連接酶16 ℃過(guò)夜連接線性化載體和片段，得到適應(yīng)于Gateway體系的帶有35S啟動(dòng)子的植物雙元超表達(dá)載體pBI121-OE。使用LR酶將目標(biāo)基因連接進(jìn)pBI121-OE得到超表達(dá)載體。再在候選基因上擴(kuò)增一段約250 bp的片段連接進(jìn)pK7GWIWG（II）得到RNAi載體。

1.2.2 ?轉(zhuǎn)基因番茄的構(gòu)建 ?利用得到的超表達(dá)和RNAi載體進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化。用5%次氯酸鈉和75%乙醇溶液對(duì)MicroTOM番茄種子進(jìn)行消毒后在T0培養(yǎng)基上培養(yǎng)。約7 d后取下番茄子葉并切下葉尖和尾部，在T1培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，準(zhǔn)備侵染液侵染葉片15 min，接著置于T1培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d，然后置于T21培養(yǎng)基在16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，每隔14 d更換1次培養(yǎng)基，待幼芽長(zhǎng)至2 cm時(shí)置于T22培養(yǎng)基中，待幼芽生長(zhǎng)成形，將其切下置于T3培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至幼苗長(zhǎng)出根和新葉后移栽至室外。

1.2.3 ?實(shí)時(shí)熒光定量PCR ?使用基因特異性引物，以TIP41作為內(nèi)參基因[34]。擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序參照SYBR qPCR Master Mix說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)總體系為10 μL，200 ng/μL的cDNA 1 μL，濃度10 μmol/L的上下游引物各0.25 μL，SYBR Mix 5 μL，雙蒸水3.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ?代謝物的檢測(cè) ?（1）組織的選?。撼磉_(dá)和RNAi植株的甾體生物堿在不同組織中的含量檢測(cè)：在獲得SlERT1b的超表達(dá)和RNAi基因沉默的陽(yáng)性植株后，取其葉片（L）、成熟綠色果實(shí)（MG）、破色期果實(shí)（Br）、破色期后5 d果實(shí)（Br+5）和破色期后10 d（Br+10）果實(shí)組織提取代謝物。乙烯處理后甾體生物堿的含量檢測(cè)：乙烯利（ET）處理組選擇成熟綠色果實(shí)（MG）和破色期果實(shí)（Br）組織提取代謝物，乙烯抑制劑（1-MCP）處理組選擇破色期果實(shí)（Br）組織提取代謝物。番茄果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期不同組織中的甾體生物堿含量檢測(cè)：采集番茄葉片（L）、未成熟綠果（IMG）、果肉為固體狀態(tài)的成熟綠果（MG1）、果肉介于固體和凝膠狀態(tài)的成熟綠果（MG2）、果肉為凝膠狀態(tài)的成熟綠果（MG3）、介于MG2和MG3的成熟綠果（MG2-3）、破色期果實(shí)（Br）、破色后5 d果實(shí)（Br+5）、破色后10 d果實(shí)（Br+10）和破色后15 d果實(shí)（Br+15）組織提取代謝物。

（2）提取與檢測(cè)：采集番茄組織樣品在液氮中速凍，使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理7 d，已凍干的樣品在研磨儀上研磨至粉末，稱(chēng)取0.05～0.1 g粉末至2 mL離心管中，加入70%甲醇渦旋30 s后置于4 ℃冰箱，每隔10 min后渦旋1次，共3次，放置在4 ℃冰箱過(guò)夜，過(guò)夜后的樣品于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清液過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中保存。在QTRAP 6500+儀器中用Scheduled MRM掃描模式進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 ?激素處理 ?分別對(duì)野生型MicroTOM番茄進(jìn)行乙烯利和乙烯抑制劑1-MCP兩組處理，每組處理至少3株野生型。選取破色期后2 d的果實(shí)和成熟綠色果實(shí)作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組分別對(duì)相應(yīng)的植株進(jìn)行處理，植株上需要至少有1個(gè)破色期果實(shí)。對(duì)植株噴灑乙烯利溶液使密閉容器中含有500 mg/L乙烯氣體;噴灑1-MCP溶液使密閉容器中含有1 mg/L 1-MCP氣體。待植株上水珠自然滴落為止，處理時(shí)間48 h，處理完的植株取破色期果實(shí)和成熟綠色果實(shí)，所有樣品在液氮中速凍并在?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 ?甾體生物堿合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控驗(yàn)證 ?首先預(yù)測(cè)了SlERT1b啟動(dòng)子上可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，結(jié)合共表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析[35]可能的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)候選轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行煙草雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選用如下組織：R85（番茄萌發(fā)后85 d的根）、S85（萌發(fā)后85 d的莖）、L85（萌發(fā)后85 d的葉）、IMG、MG、Br和Br15。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?候選基因的分析

經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（MEGA6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SlERT1b基因是茄科植物所特有的，并且與栽培型馬鈴薯的親緣關(guān)系最近（圖1A）。通過(guò)查閱番茄表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ted.bti.cornell.edu/），發(fā)現(xiàn)SlERT1b在破色期及之后的果實(shí)中特異性表達(dá)（圖1B）。同時(shí)比較了不同番茄品種中主要甾體生物堿的含量，發(fā)現(xiàn)馴化后的栽培種番茄的含量低于野生型番茄（圖1C）。

2.2 ?番茄轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建

根據(jù)α-番茄堿在果實(shí)成熟中生成七葉皂苷A等皂苷類(lèi)物質(zhì)，中間相差4步推測(cè)的化學(xué)反應(yīng)，分別有4個(gè)酶促反應(yīng)（圖2A）。GAME31參與該過(guò)程的第1步是羥化反應(yīng)，推測(cè)剩下3步反應(yīng)分別是?；?、羥化和糖基化反應(yīng)，由于候選基因是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，因此推測(cè)其參與最后一步糖基化反應(yīng)。

由于該步反應(yīng)的底物?；u基番茄堿（acetoxy-hydroxytomatine）難以獲取，所以本研究未進(jìn)行體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過(guò)酶切酶連改造得到超表達(dá)載體pBI121-OE（圖2B）。對(duì)SlERT1b進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程獲得了SlERT1b的超表達(dá)和RNAi株系（圖2C）。另外發(fā)現(xiàn)改變番茄中SlERT1b的表達(dá)，與野生型植株相比不會(huì)影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育。由于基因在紅果中特異表達(dá)，收集了轉(zhuǎn)基因株系紅果的RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其中OE-11和OE-25為超表達(dá)株系的陽(yáng)性植株，Rnai-19和Rnai-25為RNAi株系的陽(yáng)性植株（圖2D、圖2E）。

2.3 ?甾體生物堿含量的檢測(cè)

根據(jù)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描模式（MRM-IDA-EPI）確定了α-番茄堿、羥基番茄堿（hydroxytomatine）、?；褖A（acetoxyt?om?atine）、酰基羥基番茄堿和七葉皂苷A的碎片模式和保留時(shí)間。由于脫氫番茄堿及其下游物質(zhì)的含量遠(yuǎn)低于α-番茄堿及其下游物質(zhì)，所以未能成功檢測(cè)到。分別對(duì)SlERT1b的超表達(dá)和RNA干擾基因沉默植株檢測(cè)了5個(gè)不同組織的α-番茄堿等5種物質(zhì)的相對(duì)含量。發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株的葉片、成熟綠色果實(shí)和破色期果實(shí)中的酰基羥基番茄堿含量顯著低于空載體植株，RNAi植株的破色期后5 d和破色期后10 d的?；u基番茄堿含量顯著高于空載體植株（圖3A）。另外發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株在葉片和成熟綠色果實(shí)中的七葉皂苷A含量顯著高于空載體植株，而RNAi植株在葉片、破色期果實(shí)、破色期后5 d和破色期后10 d的七葉皂苷A含量顯著低于空載體植株（圖3B）。

2.4 ?乙烯參與甾體生物堿合成的調(diào)控

乙烯處理后成熟綠色果實(shí)的α-番茄堿和羥基番茄堿含量無(wú)顯著變化，?；褖A的含量顯著下降，酰基羥基番茄堿和七葉皂苷A的含量顯著升高。乙烯處理后的破色期果實(shí)除七葉皂苷A含量升高不顯著，其他都顯著升高。乙烯利抑制劑1-MCP處理后的破色期果實(shí)除七葉皂苷A和二羥基番茄堿（di-hydroxytomatine）含量顯著降低外，?其他含量均顯著升高（圖4A～圖4F）。

為了解乙烯處理是否是通過(guò)影響SlERT1b的表達(dá)進(jìn)而影響代謝物的含量，提取了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的果實(shí)RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙烯處理后不論是成熟綠色果實(shí)還是破色期果實(shí)，SlERT1b的相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，而1-MCP處理后其表達(dá)量降低（圖4G）。PG2和E4是乙烯響應(yīng)基因，受到乙烯的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量變化符合預(yù)期，證明乙烯處理有效（圖4H、圖4I）。

2.5 ?果實(shí)成熟過(guò)程甾體生物堿合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

本研究預(yù)測(cè)SlERT1b啟動(dòng)子上可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，紅色區(qū)域?yàn)镚-Box元件，綠色區(qū)域?yàn)镚CC-Box元件（圖5A）。結(jié)合共表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析，找到一些可能與SlERT1b互作的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)SlJERF1與SlERT1b的表達(dá)譜在一個(gè)聚類(lèi)中（圖5B）。對(duì)其中4個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，分別為SlJERF1、SlJERF1-like、SlAREB2和GAME9與SlERT1b啟動(dòng)子的組合，發(fā)現(xiàn)SlJERF1可以在三缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明SlJERF1與SlERT1b啟動(dòng)子區(qū)存在互作（圖5C）。另外進(jìn)行了煙草雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SlERT1b可被SlJERF1、SlAREB2和GAME9反式激活（圖5D）。

2.6 ?番茄果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期不同組織中甾體生物堿的含量變化

在番茄果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期，α-番茄堿及其下游的4種物質(zhì)羥基番茄堿、酰基番茄堿、?；u基番茄堿和七葉皂苷A發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。檢測(cè)了所有組織中的5種甾體生物堿的含量變化，首次發(fā)現(xiàn)5種甾體生物堿的含量在發(fā)育過(guò)程中依次出現(xiàn)峰值，α-番茄堿和羥基番茄堿主要存在于未成熟綠色果實(shí)，?；褖A主要存在于MG2和MG3之間，酰基羥基番茄堿主要存在于破色期果實(shí)，而七葉皂苷A主要存在于破色后的果實(shí)中（圖6A）。此外，α-番茄堿在MG3時(shí)的含量較其他時(shí)期較高，羥基番茄堿在破色期的含量較其他時(shí)期較高，推測(cè)在這一階段，α-番茄堿被誘導(dǎo)大量合成，隨之轉(zhuǎn)化為羥基番茄堿。存在一種二羥基番茄堿，它在α-番茄堿的結(jié)構(gòu)上加上2個(gè)羥基（圖6C）。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二羥基番茄堿在破色期及之后的階段顯著積累，推測(cè)在破色期含量異常上升的羥基番茄堿被轉(zhuǎn)化為二羥基番茄堿（圖6B）。

3 ?討論

本研究驗(yàn)證了一個(gè)參與番茄成熟過(guò)程甾體生物堿合成的糖基轉(zhuǎn)移酶SlERT1b。由于?；u基番茄堿是SlERT1b的潛在上游底物，而七葉皂苷A是它的潛在下游產(chǎn)物，本研究結(jié)果初步證明SlERT1b發(fā)揮著催化?；u基番茄堿生成七葉皂苷A的糖基轉(zhuǎn)移酶活性，因此可以使果實(shí)中高毒性的α-番茄堿減少，低毒性的七葉皂苷A等皂苷類(lèi)物質(zhì)增加。可以推測(cè)，植物在發(fā)育早期，葉片和未成熟果實(shí)中的α-番茄堿可以有效地防止昆蟲(chóng)等的侵害。在發(fā)育的后期，成熟的果實(shí)中帶苦味的α-番茄堿向不帶苦味的七葉皂苷A等物質(zhì)的轉(zhuǎn)變使果實(shí)適宜食用，因而可以吸引動(dòng)物的取食，使種子得以傳播。在對(duì)SlERT1b進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析后發(fā)現(xiàn)該基因是茄科植物中特有的，僅存在于番茄、馬鈴薯、辣椒和煙草等。其中與馬鈴薯中的同源基因同源性最高。我們推測(cè)馬鈴薯的同源基因可能也具有類(lèi)似的甾體生物堿糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

番茄果實(shí)的成熟伴隨著肉眼可見(jiàn)的顏色、質(zhì)地及其中的代謝物等變化，這一過(guò)程通常是由于乙烯等激素的產(chǎn)生而發(fā)生。類(lèi)胡蘿卜素如番茄紅素在成熟番茄中受到乙烯的誘導(dǎo)而大量積累[36]，還有諸多糖、酸和揮發(fā)物在成熟過(guò)程中被合成，使得果實(shí)具有良好的口感和風(fēng)味[37]。番茄作為一種呼吸躍變植物，擁有2套乙烯調(diào)節(jié)系統(tǒng)，系統(tǒng)1在全部組織中保持基礎(chǔ)的乙烯水平，系統(tǒng)2在果實(shí)成熟時(shí)大量生成乙烯，進(jìn)而影響整個(gè)成熟過(guò)程[38]。乙烯積累誘導(dǎo)了一系列果實(shí)成熟相關(guān)的基因，進(jìn)而改變番茄的顏色、質(zhì)地及代謝物等[39-40]。在本研究的乙烯及1-MCP處理實(shí)驗(yàn)中，相關(guān)的甾體生物堿含量被顯著地上調(diào)或下調(diào)。其中，乙烯處理后的成熟綠色果實(shí)的酰基番茄堿含量下降，而二羥基番茄堿含量上升，他們擁有共同的上游物質(zhì)羥基番茄堿，這意味著乙烯的處理可能激活了一種潛在的羥化酶，使得代謝途徑從主要合成?；褖A變?yōu)楹铣啥u基番茄堿，而下游物質(zhì)酰基羥基番茄堿和七葉皂苷A的含量上升意味著二羥基番茄堿可以繼續(xù)合成下游物質(zhì)。因此，乙烯可能誘導(dǎo)這一代謝途徑的所有羥化酶和糖基轉(zhuǎn)移酶，而其中的?；D(zhuǎn)移酶不能被其誘導(dǎo)。先前的研究認(rèn)為一個(gè)酮戊二酸雙加氧酶GAME31可以催化α-番茄堿合成羥基番茄堿，但同時(shí)也指出其在栽培種番茄中基因表達(dá)量較低[22]。本研究進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)GAME31不論是正常水平還是乙烯處理水平均沒(méi)有表達(dá)，因此認(rèn)為GAME31可能不是栽培種番茄中的甾體生物堿羥化酶。另外，在本研究進(jìn)行的同時(shí)，有一項(xiàng)研究也驗(yàn)證了SlERT1b能夠參與這一糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[41]。雖然這一甾體生物堿合成途徑中只有SlERT1b的功能已知，尚不確定其他步驟是由哪些酶催化的，但是本研究證明了乙烯可以影響這一代謝途徑，這將為今后的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，GAME9是甾體生物堿合成中已被報(bào)道的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在葉片和綠果等不可食用組織中特異表達(dá)，參與甾體生物堿合成途徑的調(diào)控[30]。但是在番茄成熟過(guò)程中，并沒(méi)有報(bào)道其合成的調(diào)控機(jī)理。本研究發(fā)現(xiàn)SlJERF1、SlAREB2和GAME9均對(duì)SlERT1b有調(diào)控作用，但是GAME9的表達(dá)模式不同于SlERT1b，因此不能確定其在植物中發(fā)揮調(diào)控SlERT1b的功能。SlJERF1是一個(gè)可被茉莉酸、乙烯、脫落酸和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的ERF家族轉(zhuǎn)錄因子[42]，SlAREB2是一個(gè)響應(yīng)脫落酸信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子，但其功能尚不清楚[43-44]。這些結(jié)果可以證明SlJERF1、SlAREB2和GAME9可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控SlERT1b。但目前尚不確定這些轉(zhuǎn)錄因子是否為成熟過(guò)程中影響甾體生物堿合成的最主要轉(zhuǎn)錄因子，有待今后研究。

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