曹淑君 初向華 李宗莉 張翠萍 孫向紅

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 藥劑科； 2 消化內(nèi)科)

雪膽素甲(CuⅡa)是雪膽屬植物的主要活性成分，近年來研究顯示，CuⅡa通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗血管生成及氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，可作為新型的潛在抗癌藥物[1-3]。如CuⅡa通過不可逆的促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚集及抑制凋亡抑制基因survivin的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖[1]。CuⅡa 能明顯抑制人肺癌細(xì)胞系NCI-H460和A549增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制AuroraA、STAT3及Cofilin等多種信號(hào)通路有關(guān)[4]。然而，Wnt/β-catenin信號(hào)的調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞代謝高度相關(guān)，其激活可導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞的化療抗性[5-6]。因此，靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路的治療能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)[7]。研究顯示，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的激活可導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白(β-catenin)降解障礙，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF形成復(fù)合體，進(jìn)一步使得細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、C-myc等靶基因激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)控異常，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]。CuⅡa對(duì)胃癌Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用尚少見報(bào)道，本研究旨在探討CuⅡa對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其分子作用機(jī)制，以期為胃癌的臨床治療開辟新的途徑?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。CuⅡa購自中國(guó)藥品生物制品檢定所；胎牛血清(FBS)、RIP細(xì)胞裂解液、PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Millipore公司(美國(guó))；RPMI1640培養(yǎng)基及雙抗(青霉素和硫酸鏈霉素)購自Hyclone(美國(guó))；CCK-8 試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購自DoJindo公司(日本)；β-catenin、CyclinD1、GSK-3β和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自Cell Signaling公司(美國(guó))；兔抗人C-myc購買自Abcam 公司(英國(guó))；兔抗人GAPDH購買自伊萊瑞特生物科技股份有限公司；CuⅡa以DMSO溶解成濃度為20 mmol/L，凍存于-20 ℃，使用時(shí)以無血清的RPMI1640培養(yǎng)基將CuⅡa稀釋成0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人胃癌SGC-7901細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa溶液(A、B、C、D、E、F組)孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8于37 ℃孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，每個(gè)樣本設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 以Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa溶液(A、B、C、D、E、F組)作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，上室加入含有20×105個(gè)SGC-7901細(xì)胞的懸浮液，下室加入600 μL的無血清培養(yǎng)基作用24 h，移去下室培養(yǎng)基，以甲醇固定15 min后，加入含體積分?jǐn)?shù)為0.001結(jié)晶紫溶液染色10 min。以PBS清洗后用棉簽擦去上室上面的細(xì)胞，風(fēng)干后在顯微鏡下取3個(gè)視野，照相，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力

以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa 溶液(A、B、C、D、E、F組)作用SGC-7901細(xì)胞48 h以后，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入5 μL AnnexinV-FITC 和5 μL PI solution，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min后，加入1×Annexin V Binding Solution 400 μL，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 以蛋白免疫印跡法(Western blot方法)檢測(cè)β-catenin、GSK-3β、C-myc和CyclinD1蛋白表達(dá)

以0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的CuⅡa溶液(A、B、C、D、E、F組)處理SGC-7901細(xì)胞48 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞后離心，取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在SDS-PAGE凝膠中，每個(gè)泳道加入30 μg的蛋白樣品，80 V 30 min及110 V 1 h電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后將條帶分別加入β-catenin、GSK-3β、C-myc和CyclinD1一抗液中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗37 ℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影。以Image J軟件分析目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CuⅡa對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

CuⅡa作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，A、B、C、D、E及F組細(xì)胞增殖抑制率分別為0、5.54±0.59、12.37±2.20、21.73±2.07、35.60±1.41、48.13±5.49，組間比較差異具有顯著意義(F=98.346，P<0.05)；B、C、D、E、F組細(xì)胞增殖抑制率與A組比較，差異有顯著性(P<0.05)。

2.2 CuⅡa對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移的影響

CuⅡa作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，A、B、C、D、E、F組遷移細(xì)胞數(shù)分別為168.16±13.06、144.26±8.19、125.36±10.09、103.63±7.18、79.09±4.24、46.15±11.06、48.13±5.49，組間比較差異有顯著意義(F=44.662，P<0.05)；C、D、E、F組遷移細(xì)胞數(shù)與A組比較，差異有顯著意義(t=3.652～10.243，P<0.05)；B組遷移細(xì)胞數(shù)與A組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。見圖1。

A、B、C、D、E、F分別為A、B、C、D、E、F組

2.3 各組細(xì)胞凋亡水平比較

CuⅡa作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，A、B、C、D、E及F組細(xì)胞的凋亡率分別為(10.18±0.98)%、(12.59±0.95)%、(16.34±0.74)%、(18.32±1.24)%、(32.49±0.74)%、(57.68±1.42)%，組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.812，P<0.05)；C、D、E、F組細(xì)胞的凋亡率與A組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.078～38.926，P<0.05)；B組細(xì)胞凋亡率與A組比較，差異無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.4 CuⅡa對(duì)于SGC-7901細(xì)胞β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

CuⅡa作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，在A、B、C、D、E、F組中β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β蛋白表達(dá)量比較差異均具有顯著性(F=8.494～21.763，P<0.05)；C、D、E、F組β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β的蛋白表達(dá)量與A組比較，差異均有顯著性(t=2.889～7.868，P<0.05)；而B組β-catenin、C-myc、CyclinD1和GSK-3β蛋白表達(dá)量相與A組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。見圖3、表1。

3 討 論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的主要原因[10]。特別是在中國(guó)，胃癌高居惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，死亡率高達(dá)36%[11]。胃癌患者的臨床治療包括手術(shù)及化療和放療等輔助治療[12]。但總體治療效果有限，因此胃癌的治療仍面臨重大的挑戰(zhàn)[13-14]。

研究顯示，中藥對(duì)腫瘤有一定的抑制作用，具有副作用小、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，易于被患者接受[15-16]。在醫(yī)療實(shí)踐中，中醫(yī)藥被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療中[17-19]。CuⅡa是中藥雪膽的主要成分，毒性低，具有抗炎、抗腫瘤等作用[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)CuⅡa可抑制肺腺癌細(xì)胞的黏附和遷移，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。本研究通過觀察CuⅡa處理后胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、侵襲和遷移情況的變化，探討CuⅡa是否具有抗胃癌的作用。結(jié)果顯示，CuⅡa處理后的C、D和E組細(xì)胞活力和遷移穿膜細(xì)胞數(shù)量均低于A組，但細(xì)胞總凋亡率均高于A組，提示CuⅡa具有抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)其凋亡的作用。

A、B、C、D、E、F分別為A、B、C、D、E、F組

A、B、C、D、E、F分別為A、B、C、D、E、F組

表1 CuⅡa對(duì)SGC-7901細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Wnt/β-catenin是一個(gè)經(jīng)典的信號(hào)通路，對(duì)人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有重要意義[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)β-catenin有多種功能，可通過Wnt/β-catenin途徑發(fā)揮重要的作用，也是整條通路的關(guān)鍵樞紐分子[24-25]。當(dāng)Wnt/β-catenin在腫瘤細(xì)胞中處于激活狀態(tài)時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)相關(guān)蛋白結(jié)合以后，在低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)作用下，激活細(xì)胞內(nèi)的蓬亂蛋白(Dvl)使GSK-3β發(fā)生磷酸化并抑制其活性，導(dǎo)致β-catenin與Ecadherin、APC、Axin、GSK-3β等復(fù)合物解離，進(jìn)而使得β-catenin去磷酸化，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與TCF/LEF形成復(fù)合物，誘導(dǎo)其下游靶基因C-myc、CyclinD1激活，通過調(diào)控細(xì)胞分化和生長(zhǎng)來調(diào)控細(xì)胞周期[26-27]。反之，當(dāng)Wnt受體沒有與Wnt配體結(jié)合時(shí)，細(xì)胞內(nèi)β-catenin降解復(fù)合物形成，促進(jìn)了β-catenin的降解，抑制了Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[6,28]。因此，β-catenin目前已經(jīng)成為治療腫瘤重要靶點(diǎn)之一，因此抑制該通路的活化為腫瘤的治療提供了新的可行性。

為進(jìn)一步探討CuⅡa對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，本研究檢測(cè)了β-catenin、C-myc、CyclinD1以及GSK-3β蛋白的表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CuⅡa作用SGC-7901細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中β-catenin、C-myc和CyclinD1蛋白水平均顯著下調(diào)，GSK-3β蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。但B組細(xì)胞β-catenin、GSK-3β、C-myc和CyclinD1蛋白表達(dá)與A組比較無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與劑量不夠，達(dá)不到抑制蛋白表達(dá)的作用有關(guān)。本研究結(jié)果表明，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，CuⅡa可能是通過激活GSK-3β的表達(dá)導(dǎo)致β-catenin復(fù)合物無法形成而抑制β-catenin蛋白，進(jìn)而抑制C-myc和CyclinD1的蛋白表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，CuⅡa抑制胃癌發(fā)生的機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin通路激活有關(guān)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖及其遷移能力。因此，CuⅡa可能是胃癌治療的潛在抗癌藥物，其抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路和隨后下調(diào)Wnt靶基因的表達(dá)可能是抑制胃癌發(fā)生的分子機(jī)制。其抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制為該重要天然產(chǎn)物后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。