彭亮 段碩 李永紅 徐輝 楊茜 唐錫龍

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 青島 266003； 2 平邑縣人民醫(yī)院急診科； 3 武漢亞洲心臟病醫(yī)院心內(nèi)科)

血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖是血管內(nèi)膜增生的關(guān)鍵，內(nèi)膜增生是一種普遍而嚴重的病理過程，可導(dǎo)致動脈硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等[1]。當血管發(fā)生損傷時，VSMCs遷移到內(nèi)膜，開始增殖并分泌細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致動脈內(nèi)膜擴張，即新生內(nèi)膜形成，從而進一步導(dǎo)致嚴重的心血管疾病，如高血壓、缺血性疾病等[2]。研究發(fā)現(xiàn)纈沙坦在降低血壓的同時，還能抑制血管平滑肌細胞的遷移與增殖，減輕血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜的增生，降低術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生[3-5]。絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1(SRSF1)是選擇性剪接因子家族的典型成員之一,其在調(diào)控mRNA代謝、維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)控細胞活力以及調(diào)節(jié)細胞周期進展方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[6-9]。但SRSF1在血管系統(tǒng)中具體的作用機制尚不清楚。最近有研究發(fā)現(xiàn)SRSF1在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞衰老及促進血管平滑肌細胞增殖方面發(fā)揮重要作用[9-11]。本研究通過觀察纈沙坦治療前后球囊損傷模型中大鼠主動脈血管內(nèi)膜SRSF1的表達情況，探討纈沙坦對血管內(nèi)皮損傷后再狹窄的作用及其機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與處理

取健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量為250～300 g，購買于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。隨機分為對照組、手術(shù)組和纈沙坦組，每組各16只大鼠。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，從術(shù)前1 d至術(shù)后14 d(或28 d)，手術(shù)組和對照組大鼠每天分別給予5 mL蒸餾水灌胃，纈沙坦組大鼠每天將20 mg/kg纈沙坦溶于5 mL蒸餾水中進行灌胃。大鼠稱體質(zhì)量后以3 g/L的戊巴比妥鈉(20 mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，取頸部正中切口切開皮膚，仔細分離血管后，使用注射器經(jīng)頸總靜脈給予100 U/kg低分子肝素鈉抗凝。手術(shù)組和纈沙坦組大鼠均行主動脈球囊損傷術(shù)，操作方法如下：將自制的2F球囊導(dǎo)管自大鼠的左頸總動脈緩慢插入至腹主動脈下端，以0.08～0.10 mL無菌氯化鈉鹽水充盈球囊，將導(dǎo)管向不同方向抽拉3次，使主動脈內(nèi)膜充分剝脫；對照組大鼠操作與手術(shù)組相同，但未注水充盈擴張球囊。所有大鼠手術(shù)完成后，縫合并且消毒切口，然后肌注200 000 U青霉素預(yù)防感染。各組分別于術(shù)后第14天和第28天處死各8只大鼠，收集近主動脈弓血管5 mm，以40 g/L多聚甲醛溶液固定后備用。

1.2 大鼠主動脈血管內(nèi)膜增生的檢測

將固定好的血管以石蠟包埋并5 μm厚切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜增生情況，使用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)檢測內(nèi)膜厚度。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血管組織中SRSF1 mRNA表達情況

使用Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國)從血管組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，SRSF1上游引物序列：5′-CACTGGTGTCGTGGAGTTTGTACGG-3′，下游引物序列：5′-GGGCAGGAATC-CACTCCTATG-3′，擴增片段長為126 bp。內(nèi)參β-actin上游引物序列：5′-CCTAGACGTCGATCAA-GAGA-3′，下游引物序列：5′-GGAACGAAGGCT-CGAAGA-3′，擴增片段長為126 bp。使用PCR儀進行擴增，以2-△△CT方法比較樣本基因表達差異。

1.4 免疫熒光法檢測血管組織中SRSF1蛋白表達

將血管標本石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇水化、脫蠟后，在乙二胺四乙酸溶液中煮沸進行抗原修復(fù)。滴加兔抗SRSF1(1∶80)一抗(Thermo Fisher公司，美國)，將載玻片放入濕盒內(nèi)4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加二抗，室溫下避光孵育50 min。PBS洗滌后，用DAPI溶液對細胞核染色5 min，PBS洗滌3次后，滴加防萃滅劑，封片。將切片置于徠卡倒置熒光顯微鏡下進行觀察并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血管組織的形態(tài)學(xué)比較

對照組大鼠主動脈球囊損傷術(shù)后第14天和第28天時主動脈內(nèi)膜光滑，均無明顯損傷及斑塊形成，而手術(shù)組和纈沙坦組血管內(nèi)均可見新生內(nèi)膜增生，創(chuàng)面均有不同程度的內(nèi)皮細胞覆蓋，內(nèi)彈力膜部分斷裂(圖1A～F)。手術(shù)后第14天，對照組、手術(shù)組以及纈沙坦組血管內(nèi)膜的厚度分別為(23.70±8.64)、(88.31±8.07)、(74.59±8.12)μm。術(shù)后第28天的內(nèi)膜厚度分別為(25.47±8.34)、(117.04±8.23)、(80.65±8.14)μm。重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，組別、時間、時間與組別(交互作用)對大鼠主動脈血管內(nèi)膜的厚度均有顯著影響(F組別=372.90，F(xiàn)時間=26.13，F(xiàn)交互=12.31，P<0.05)；與對照組相比，術(shù)后第14、28天手術(shù)組與纈沙坦組內(nèi)膜厚度均明顯增加，纈沙坦組內(nèi)膜厚度較手術(shù)組明顯降低(F=176.43、241.08，P<0.05)。

2.2 各組血管組織中SRSF1 mRNA表達情況

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，術(shù)后第14天，對照組、手術(shù)組、纈沙坦組血管內(nèi)膜SRSF1 mRNA相對表達量分別為(0.24±0.17)、(1.17±0.15)、(0.72±0.13)。術(shù)后第28天SRSF1 mRNA的相對表達量分別為0.27±0.12、1.52±0.19、0.98±0.19。重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，組別、時間以及時間與組別(交互作用)對大鼠主動脈血管內(nèi)膜SRSF1 mRNA相對表達量具有顯著影響(F組別=184.60，F(xiàn)時間=21.15，F(xiàn)交互=4.22，P<0.05)。單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，術(shù)后第14、28天，手術(shù)組、纈沙坦組血管內(nèi)膜SRSF1 mRNA的相對表達量較對照組明顯升高，纈沙坦組SRSF1 mRNA的相對表達量較手術(shù)組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.18、32.71，P<0.05)。

2.3 各組血管組織中SRSF1蛋白的表達情況

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，術(shù)后第14、28天對照組大鼠血管組織中SRSF1蛋白熒光強度極低，手術(shù)組和纈沙坦組熒光強度顯著高于對照組，纈沙坦組熒光強度明顯低于手術(shù)組。與術(shù)后第14天相比，術(shù)后第28天手術(shù)組、纈沙坦組血管組織中SRSF1蛋白熒光強度均明顯增加，見圖2A～2F。

A～C分別為對照組、手術(shù)組、纈沙坦組術(shù)后第14天內(nèi)膜增生情況；D～F分別為對照組、手術(shù)組、纈沙坦組術(shù)后第28天內(nèi)膜增生情況，HE染色，200倍

A～C分別為對照組、手術(shù)組、纈沙坦組術(shù)后第14天血管組織中SRSF1蛋白的表達情況；D～F分別為對照組、手術(shù)組、纈沙坦組術(shù)后第28天血管組織中SRSF1蛋白的表達情況，免疫熒光染色，200倍

3 討 論

在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)過程中，球囊擴張與支架展開時對血管壁造成的機械性損傷，一直是引起術(shù)后血管再狹窄的重要因素，嚴重影響患者預(yù)后[12]。因此，有效地預(yù)防血管再狹窄的發(fā)生，可進一步提高PCI的治療效果。研究表明，PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生可能與血管彈性回縮、炎癥反應(yīng)及VSMCs過度增殖等有關(guān)[13]。

在正常情況下，VSMCs在動脈血管中膜中是維持非增殖狀態(tài)的[14]。當受到損傷或其他刺激時，VSMCs遷移到內(nèi)膜，開始增殖并分泌細胞外基質(zhì)，促進新內(nèi)膜的形成，可能是導(dǎo)致PCI術(shù)后嚴重心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，如高血壓、缺血性疾病以及后續(xù)的心肌梗死、中風和充血性心力衰竭等的主要原因[15]。VSMCs異常增殖與動脈粥樣硬化和損傷后新內(nèi)膜形成導(dǎo)致的再狹窄密切相關(guān)[16-17]。本研究中，球囊損傷主動脈內(nèi)皮后手術(shù)組及纈沙坦組以術(shù)后第14、28天血管內(nèi)均可見新生內(nèi)膜增生，創(chuàng)面均有不同程度的內(nèi)皮細胞覆蓋，內(nèi)彈力膜部分斷裂，血管內(nèi)膜較對照組明顯增厚，說明血管損傷后由于血管內(nèi)膜增生形成了血管再狹窄。與術(shù)后第14天相比，手術(shù)組術(shù)后第28天血管內(nèi)膜的增生程度進一步加重，提示血管損傷后再狹窄的程度會隨著時間的推移進一步加重。而使用纈沙坦藥物干預(yù)后，術(shù)后第14、28天的血管內(nèi)膜增生程度均明顯小于未使用藥物干預(yù)的手術(shù)組，血管內(nèi)皮的增生程度變輕。提示纈沙坦可有效減輕血管內(nèi)膜損傷后內(nèi)膜的增生情況。

SRSF1參與多種病理過程，包括病毒感染和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程[18-20]。有研究表明，SRSF1的上調(diào)可促進動脈損傷時VSMCs的增殖響應(yīng)或促進有絲分裂刺激新內(nèi)膜形成，而SRSF1的缺失則減弱了血管損傷或者有絲分裂刺激的反應(yīng)[20-24]。XIE等[11]研究顯示，SRSF1通過Δ133p53/EGR1/KLF5路徑促進VSMCs的增殖。由于增強的VSMCs增殖與許多血管增生性疾病的發(fā)病有關(guān)，因此應(yīng)該對包括動脈粥樣硬化、支架內(nèi)冠狀動脈再狹窄等疾病采取抗增殖治療[25-26]。本研究中，手術(shù)組及纈沙坦組血管組織中SRSF1 mRNA相對表達量較對照組均明顯升高，但纈沙坦組SRSF1 mRNA表達量較手術(shù)組降低，本研究結(jié)果也驗證了上述觀點。

纈沙坦作為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)的代表藥物，除了具有降壓作用外，還可以通過抑制VSMCs的遷移及增殖，減輕血管內(nèi)膜損傷后內(nèi)膜的增生，降低術(shù)后再狹窄的發(fā)生[27-30]。本研究中，手術(shù)組血管內(nèi)膜厚度明顯高于纈沙坦組，說明血管內(nèi)膜損傷后SRSF1的mRNA及蛋白均是高表達，經(jīng)纈沙坦治療后，損傷的血管組織中SRSF1 mRNA以及蛋白表達水平較治療前均明顯降低，內(nèi)膜增厚程度明顯受限，說明SRSF1 mRNA以及蛋白在調(diào)節(jié)VSMCs增殖及其在新內(nèi)膜增生的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

由此可以推斷SRSF1可能通過促進VSMCs的遷移和增殖，進一步促進血管損傷后內(nèi)膜增厚。SRSF1在增生的血管內(nèi)皮及平滑肌細胞中表達增加，可能與其促進平滑肌細胞增殖和新生內(nèi)膜增厚有關(guān)。SRSF1表達的變化是否與纈沙坦的作用直接相關(guān)，目前仍未知。總之，纈沙坦可有效減輕內(nèi)膜損傷血管的內(nèi)膜增生程度，其作用機制可能與其下調(diào)血管組織中SRSF1 mRNA及蛋白的表達有關(guān)。