王賽男 任皓 孫銀銀 李新 劉思宇 徐曉雨 盧恕來(lái)

(1 濱州市人民醫(yī)院口腔科，山東 濱洲 256600； 2 大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院；3 山東省立醫(yī)院口腔科； 4 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心)

唾液腺腺樣囊性癌(SACC)是一種源于上皮組織且具有獨(dú)特生物學(xué)行為的惡性腫瘤，可發(fā)生在所有年齡階段，中老年人群發(fā)病較多，無(wú)明顯性別差異，具有易復(fù)發(fā)、常侵犯周圍神經(jīng)組織、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床特點(diǎn)[1]。早期患者常出現(xiàn)如感覺異常、麻木、疼痛及面癱等神經(jīng)受累癥狀，在口腔頜面部腫瘤中轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高,早期轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%[2]，而肺部是其晚期最常見的轉(zhuǎn)移部位[3]。SACC對(duì)放化療均不敏感,臨床上主要通過(guò)手術(shù)切除的方式治療,但是患者術(shù)后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率均較高[4]，預(yù)后不佳。SACC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，探究與SACC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物仍是目前臨床研究的熱點(diǎn)[5],一方面能夠作為SACC診斷的篩檢指標(biāo),可以早期發(fā)現(xiàn)患者，從而開展早期防治；另一方面,對(duì)探究疾病的發(fā)病機(jī)制和制定新的治療方案均具有重要的指導(dǎo)意義[6]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是一種尋找腫瘤潛在生物標(biāo)記物的穩(wěn)定、準(zhǔn)確、有效的方法。該學(xué)科以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)正常及病理個(gè)體間的蛋白質(zhì)組比較分析，找到某些“疾病特異性的蛋白質(zhì)分子”，這些分子既可以作為新藥設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，同時(shí)也是疾病早期診斷的分子標(biāo)記物。當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)為雙向熒光差異凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)雙向熒光差異凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行鑒定。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)比較SACC組織與癌旁正常腮腺組織中某些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，為臨床上尋找SACC早期診斷、治療和監(jiān)測(cè)預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

本研究中所有組織標(biāo)本均取自2018年1月—2019年8月于青島市市立醫(yī)院確診為SACC的4例患者，其中男2例，女2例，平均年齡為46歲。腫瘤部位均位于腮腺，TNM分期分別為T2NXM0、T2N1M0、T3N1M0、T4aN1M0。手術(shù)過(guò)程中分別留取4例患者的癌組織及其癌旁正常腮腺組織標(biāo)本。癌組織均經(jīng)病理學(xué)檢查以及免疫組化證實(shí)為SACC，癌旁正常腮腺組織為癌灶周圍3 cm以外正常腮腺組織，也經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。按照世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)分類[7]。所有標(biāo)本裝入已標(biāo)記好的冷凍管內(nèi)，迅速放入液氮罐中，實(shí)驗(yàn)前轉(zhuǎn)存-80 ℃低溫冰箱備用?；颊呔炇鹆酥橥鈺?；樣本和臨床資料收集遵循“赫爾辛基宣言”并經(jīng)過(guò)青島市倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：2018臨審字第021號(hào))。

1.2 試劑

Cydye2、Cydye3和Cydye5購(gòu)于美國(guó)GE公司；二甲基甲酰胺購(gòu)于美國(guó)Aldrich公司；等電聚焦電泳膠條購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；Thiourea購(gòu)于瑞士Fluka公司；蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)于美國(guó)羅氏公司；ACN和甲醇購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；TFA購(gòu)于德國(guó)默克公司；胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)普羅米加公司。

1.3 研究方法

1.3.1蛋白樣本制備 將所有組織標(biāo)本分別在液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，然后將粉末樣本按照1∶10(W/V)加入組織裂解液，旋轉(zhuǎn)混勻，超聲震蕩60 s，室溫提取30 min，于4 ℃下以13 000 r/min離心20 min，小心收集上清液，避免取到上層脂肪層，分裝后-80 ℃凍存。4例SACC組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常腮腺組織配對(duì)成4組樣本。

1.3.2雙向熒光差異凝膠電泳 每一組樣本各取50 μg，分別加入0.1 mmoL/L Cydye5和Cydye3各0.5 μL，避光冰上標(biāo)記2 h(4組樣本中隨機(jī)選取1組樣本為反向標(biāo)記)；內(nèi)參樣本取50 μg(25 μg SACC組織以及25 μg癌旁正常的腮腺組織)，以0.1 mmoL/L Cydye2 0.5 μL標(biāo)記，避光冰上標(biāo)記2 h。將所有樣品加入10 mmoL/L賴氨酸1 μL中止標(biāo)記。4 ℃下標(biāo)記反應(yīng)30 min后采用IPG膠條(pH 4～7,NL 24 cm)進(jìn)行第1向等電聚焦電泳(IEF)。用Ettan DALT系統(tǒng)進(jìn)行第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。標(biāo)記和電泳后，用Typhoon 9410熒光掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描并獲得3張膠的圖片，為后續(xù)差異表達(dá)蛋白篩選做準(zhǔn)備。用DeCyder 5.02軟件將Cydye3及Cydye5凝膠圖片疊加得到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，差異蛋白點(diǎn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行定量比較，并對(duì)將膠上重復(fù)性較好差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解(胰蛋白酶處理20 h)，提取酶解肽段。然后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDL-TOF-MS)，并與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，完成蛋白質(zhì)種類鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

由DeCyder 5.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SACC組織及癌旁正常腮腺組織之間差異蛋白定量比較采用t檢驗(yàn)，以兩組蛋白含量比值(Average ratio)在1.5倍及以上，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，被認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。

2 結(jié) 果

通過(guò)熒光掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描后，得到樣本中蛋白在膠圖中的分布情況(圖1)，白色的點(diǎn)代表沒有差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，紅色和綠色的點(diǎn)代表SACC組織和癌旁正常腮腺組織有差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。采用DeCyder 5.02軟件將Cydye3和Cydye5凝膠圖片疊加后顯示有39個(gè)SACC組織和癌旁正常腮腺組織差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(圖2)，圖中黃色標(biāo)注的數(shù)字代表蛋白質(zhì)編號(hào)；對(duì)39個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行定量比較，結(jié)果有24個(gè)表達(dá)上調(diào)(蛋白質(zhì)編號(hào)為276、300、524、782、788、801、802、804、819、826、834、844、847、1213、1284、1318、1509、1518、1605、1607、1611、1625、2007)，15個(gè)表達(dá)下調(diào)(蛋白質(zhì)編號(hào)為372、380、768、858、863、966、1202、1400、1407、1409、1419、1569、1797、1888、2103)；采用MALDL-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，熒光掃描后發(fā)現(xiàn)有5個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(蛋白質(zhì)編號(hào)分別為834、1213、788、1509、1611)重復(fù)性較好，進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜分析得到5種蛋白質(zhì)，分別為α-淀粉酶1、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)、LASP1蛋白以及PFN1蛋白，所有蛋白表達(dá)量均上調(diào)。

3 討 論

大多數(shù)SACC組織中含基底樣細(xì)胞巢，周圍常有硬化的基底膜樣物質(zhì)環(huán)繞，細(xì)胞呈圓柱狀，故又稱為圓柱瘤或圓柱瘤型腺癌。SACC占唾液腺腫瘤的5%～10%，約占唾液腺惡性腫瘤的24%。國(guó)內(nèi)對(duì)SACC及癌旁正常腮腺組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道較少，本研究通過(guò)對(duì)SACC組織和癌旁正常腮腺組織進(jìn)行了雙向熒光差異凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)有39個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并鑒定出5種表達(dá)量上調(diào)、重復(fù)性好，且與SACC密切相關(guān)的蛋白質(zhì)(α-淀粉酶1、GRP、PDI、LASP1以及PFN1)。

A：Cydye2標(biāo)記的內(nèi)參樣本，波長(zhǎng)488 nm；B：Cydye3標(biāo)記的正常組織，波長(zhǎng)532 nm；C：Cydye5標(biāo)記的SACC組織，波長(zhǎng)633 nm

圖2 SACC組織和癌旁正常腮腺組織差異表達(dá)蛋白點(diǎn)

α-淀粉酶1是腮腺、下頜下腺及舌下腺中釋放唾液的關(guān)鍵消化酶。在肺癌、肝癌、胰腺癌和唾液腺癌患者體內(nèi)總血清淀粉酶量增高，可通過(guò)電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)[8]?；加袧{細(xì)胞瘤的患者，其瘤漿細(xì)胞可直接產(chǎn)生唾液型淀粉酶，唾液型淀粉酶的表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)增殖[9]。本研究顯示α-淀粉酶1在SACC組織中表達(dá)升高，提示α-淀粉酶1過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)了SACC的生長(zhǎng)。

GRP是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)的一類應(yīng)激蛋白，其中GRP78屬于熱激性蛋白70家族的一員，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的GRP78在未折疊蛋白反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,能夠保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子平衡并抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的生成[10],是主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和應(yīng)激誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)的標(biāo)志蛋白,也是細(xì)胞維持正常功能的調(diào)節(jié)蛋白。GRP78在多數(shù)的正常組織中呈低表達(dá),但是在腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯增高[11]，且GRP78的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥性[12-13]。研究表明，在胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等多種癌組織中GRP78的表達(dá)情況與患者預(yù)后密切相關(guān)[14-18]。此外，有文獻(xiàn)表明特異性下調(diào)GRP78的表達(dá)可以抑制人ACC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而且該抑制作用可能與MMP和TIMP的表達(dá)有關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中SACC組織中GRP的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常腮腺組織，提示GRP在SACC發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。

PDI不僅在腫瘤組織中高表達(dá)，而且還與腫瘤侵襲和多種腫瘤類型的轉(zhuǎn)移相關(guān)，如卵巢癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞癌、乳腺癌，提示可作為腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)記物[20]。PDI表達(dá)水平還可能與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性有關(guān)，表達(dá)水平越高提示腫瘤惡性程度越高[21]。本研究中PDI在SACC中高表達(dá)，表明PDI也可能是SACC診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)記物。

LASP1蛋白是一種黏著斑蛋白，其特殊結(jié)構(gòu)為細(xì)胞的遷移提供了條件[22]。LASP1蛋白在鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常腮腺組織，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期有關(guān)，而與腫瘤大小及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)LASP1表達(dá)上調(diào)與乳腺癌、鼻咽癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、口腔鱗癌、腎透細(xì)胞癌、胃癌及肝細(xì)胞癌的增殖關(guān)系密切[24-28]，并能增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，LASP1蛋白在SACC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常腮腺組織，提示LASP1蛋白可能參與SACC的形成過(guò)程。

PFN1不僅參與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，還參與了腫瘤血管形成過(guò)程，以往研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)肺癌A549細(xì)胞中的PFN1能抑制細(xì)胞遷移并使A549細(xì)胞對(duì)抗癌藥物敏感[29]。而在肝癌體外實(shí)驗(yàn)中，PFN1的過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲有明顯的抑制作用[30]。在本實(shí)驗(yàn)中PFN1在SACC中高表達(dá)提示其可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

總之，本研究中檢測(cè)到的差異表達(dá)蛋白α-淀粉酶1、GRP、PDI、LASP1以及PFN1很可能是SACC潛在的組織特異性生物標(biāo)記物，并且有可能成為臨床上診斷或治療的潛在靶點(diǎn)，這將為臨床上該病的早期診斷及治療提供新的思路和方法。