胡建平 韓俊壘 邊紅芝

(河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450002)

在2019年的世界衛(wèi)生組織的報(bào)告中，全球已有1 000萬(900萬～1 100萬)人患有結(jié)核病，其中因病死亡率為132/10萬，且以低收入及中等收入國家占比最多[1]。我國屬于結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，近幾年隨著結(jié)核病防治工作的展開，國內(nèi)活動(dòng)性肺結(jié)核患病率雖有下降，但整體的患病情況依然并不樂觀[2]。結(jié)核病的早期診斷與控制依然是國內(nèi)工作重點(diǎn)。結(jié)核病防治的關(guān)鍵是早期和準(zhǔn)確地確診[3]。目前我國結(jié)核病診斷方法多參照世界衛(wèi)生組織所推薦的細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)，即痰涂片與細(xì)菌培養(yǎng)[4]。但這兩種診斷技術(shù)均易受痰樣本質(zhì)量與結(jié)核分枝桿菌菌體結(jié)構(gòu)的影響，檢測的靈敏度偏低，因此尋找靈敏度與特異度均更為理想的診斷方法極為必要[5]。目前血清學(xué)診斷多被用于多種疾病的早期診斷[6]，也已有研究初步探討該檢測方法針對結(jié)核病診斷的特異度與靈敏度[7]。菌陰肺結(jié)核是指1次痰培養(yǎng)、3次痰涂片結(jié)果均為陰性的肺結(jié)核，這類肺結(jié)核相對特殊，因診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，故早期非常容易誤診和漏診，故對于這類患者可以考慮應(yīng)用血清學(xué)方法診斷檢出[8-9]。Rv2991、Rv3428c是新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原，本研究旨在探討結(jié)核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰肺結(jié)核的價(jià)值，為菌陰肺結(jié)核的血清學(xué)診斷提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年3月—2018年5月我院收治的初治菌陰肺結(jié)核患者100例(A組)，同期在我院接受治療的其他肺部疾病患者100例(B組)及行常規(guī)全身體檢健康者100例(C組)作為對照。3組研究對象年齡均≥18歲，A組均為菌陰肺結(jié)核患者，符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[10]中菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)；B組經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢查確診為非結(jié)核病患者，但有咳痰、咯血等肺結(jié)核主要臨床癥狀。A組男61例，女39例；年齡27～65歲，平均(40.21±10.11)歲；體質(zhì)量44～77 kg，平均(60.21±10.20)kg；受教育程度：初中及以下37例，中?；蛘吒咧?0例，大專及以上23例。B組男60例，女40例；年齡28～65歲，平均(41.41±10.39)歲；體質(zhì)量45～75 kg，平均(59.12±9.20)kg；受教育程度：初中及以下40例，中專或高中38例，大專及以上22例。C組男65例，女35例；年齡26～65歲，平均(39.47±10.07)歲；體質(zhì)量45～78 kg，平均(60.44±10.31)kg；受教育程度：初中及以下38例，中?；蚋咧?6例，大專及以上26例。3組性別、年齡、體質(zhì)量、受教育程度等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部納入者對研究內(nèi)容均知情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤疾病者，心、肝、腎等重要臟器功能不全者，意識(shí)障礙或精神疾病等無法很好地配合研究者，合并血液系統(tǒng)疾病者，合并免疫疾病者，參加本次研究的同時(shí)還參加其他相關(guān)研究者。

1.2 主要儀器與試劑

質(zhì)粒pET-28a、大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞系本室保存，其感受態(tài)細(xì)胞由本課題組制備。Rv2991、Rv3428c蛋白全基因及引物由華大基因公司合成。DG3022A酶標(biāo)儀、洗板機(jī)購買于美國BIO-RAD公司，ND-1000型蛋白測量儀購買于美國Nano Drop公司。內(nèi)切酶及其他酶類購買于大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、微量蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG、顯色液等購買于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增 上下游引物設(shè)計(jì)：上游引入酶切位點(diǎn)，下游將終止子去掉并引入酶切位點(diǎn)。然后以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組DNA作為模板，在DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增，條件：94 ℃預(yù)變性5 min后；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min終止反應(yīng)，使用PCR試劑盒回收目的基因。

1.3.2表達(dá)工程菌pET28a-Rv2991以及pET28a-Rv3428c的構(gòu)建 對目的基因及載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收產(chǎn)物后加入連接酶過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)接至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在38 ℃的條件下培養(yǎng)過夜；將過夜后長出的細(xì)菌菌落接種至液體培養(yǎng)基中，搖晃提取質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶行雙酶切鑒定，鑒定成功后送至實(shí)驗(yàn)室完成測序驗(yàn)證，獲得表達(dá)工程菌pET28a-Rv2991和pET28a-Rv3428c。

1.3.3Rv2991、Rv3428c重組蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)以及純化 將表達(dá)工程菌pET28a-Rv2991以及pET28a-Rv3428c轉(zhuǎn)接至含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)約8 h，離心收集菌體，并進(jìn)行超聲破碎。提取總蛋白后，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達(dá)形式。采用美國GE公司的AKTA純化流程進(jìn)行純化，蛋白純化后使用微量BCA蛋白定量試劑盒檢測各Rv2991、Rv3428c重組蛋白的表達(dá)水平。操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定受試者血清吸光度值 采集受試者入組次日清晨空腹靜脈血5 mL，1 h內(nèi)3 300 r/min離心10 min分離血清，立即分裝并于-70 ℃冰箱保存，所有樣本無反復(fù)凍融，并在3個(gè)月以內(nèi)完成檢測。使用棋盤滴定法檢測Rv2991、Rv3428c重組蛋白血清最佳稀釋度與最佳包被濃度，使用酶標(biāo)儀讀取450 mm波長處的各血清樣本的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3組受試者血清中Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達(dá)水平比較

3組受試者的血清中結(jié)核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達(dá)水平比較差異具有顯著意義(F=649.451～2 156.945，P<0.05)，其中A組患者血清中結(jié)核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達(dá)水平高于B、C組(q=43.381～81.529，P<0.05)，B組與C組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試者血清結(jié)核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達(dá)水平比較

2.2 Rv2991、Rv3428c重組蛋白用于菌陰肺結(jié)核輔助診斷的效能

將B組作為對照，繪制ROC曲線，血清當(dāng)中的Rv2991、Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰肺結(jié)核的曲線下面積分別為0.834(95%CI=0.778～0.895)、0.829(95%CI=0.771～0.884)，同時(shí)cut-off值分別為58 000.50和48 500.50，并且在該值之下，血清中Rv2991、Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰性肺結(jié)核的靈敏度分別為92.3%和81.5%，特異度則分別為85.5%和82.0%。見圖1a、b。

3 討 論

目前，我國結(jié)核病以患病率高、感染率高、不同地區(qū)間患病率差異大為主要特點(diǎn)[11]，在全部結(jié)核病患者中，菌陰肺結(jié)核發(fā)病率、誤診漏診率、病死率均較高[12]。菌陰肺結(jié)核是指痰涂片抗酸桿菌及痰培養(yǎng)分枝桿菌結(jié)果均為陰性的結(jié)核病，屬于活動(dòng)性肺結(jié)核，在全部肺結(jié)核患者中占比超60%[13-14]。結(jié)核病前期多經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢測來確定傳染源[15]，同時(shí)細(xì)菌學(xué)檢測也是結(jié)核病治療的主要的依據(jù)[16]。然而細(xì)菌學(xué)檢測易受諸多因素影響，早期診斷的特異度與靈敏度相對較低[17]。目前，諸多檢查手段的出現(xiàn)與使用使得菌陰肺結(jié)核的前期診斷有所提高，尤其是血清免疫學(xué)與分子基因?qū)W等諸多檢測手段的使用，為菌陰肺結(jié)核的早期診斷帶來突破[18]。

a：Rv2991重組蛋白，b：Rv3428c重組蛋白

本研究分析Rv2991與Rv3428重組蛋白在菌陰肺結(jié)核中的表達(dá)，并將其用于菌陰肺結(jié)核患者的輔助診斷，旨在觀察兩者用于菌陰肺結(jié)核診斷的價(jià)值。結(jié)核分枝桿菌Rv2991與Rv3428重組蛋白均是結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，能夠引起機(jī)體的細(xì)胞與體液免疫，是機(jī)體重要的免疫原[19-20]。但因兩者均是最近才發(fā)現(xiàn)的免疫原，故將其用于菌陰肺結(jié)核診斷是否有一定價(jià)值尚無相關(guān)報(bào)道。既往的研究報(bào)道證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌特異抗原可用于結(jié)核病的血清學(xué)輔助診斷，且診斷的特異度及靈敏度均較高，是迄今可以作為單項(xiàng)檢查用于結(jié)核病診斷的最佳抗原之一，也是目前商品化試劑盒中被廣泛使用的一種抗原[21-23]。Rv2991與Rv3428c均是經(jīng)仿生親和、免疫層析、蛋白分離純化、蛋白免疫原性生物信息學(xué)分析及表位預(yù)測等技術(shù)篩選出的新的且在臨床檢驗(yàn)中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的重要免疫標(biāo)志物[24]。前者是以pET28a作為載體，與相關(guān)的抗原構(gòu)建充足質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至菌株內(nèi)，利用原核表達(dá)，對目的蛋白進(jìn)行純化，成功獲得誘導(dǎo)的純化表達(dá)抗原[25]。本研究結(jié)果顯示，Rv2991、Rv3428抗原作為一種重組蛋白，在A組表達(dá)最高，其次為B組，C組表達(dá)最低；進(jìn)一步繪制ROC曲線，以B組作為對照，驗(yàn)證其用于菌陰肺結(jié)核輔助診斷的效能，結(jié)果顯示Rv2991重組蛋白診斷菌陰肺結(jié)核的曲線下面積為0.834，cut-off值為58 000.50，在該吸光度58 000.50值下，Rv2991重組蛋白輔助診斷菌陰性肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別為92.3%和85.5%，曲線下面積值與診斷靈敏度、特異度均較高，有著較高的診斷價(jià)值。Rv3245c是RD11區(qū)典型基因，近幾年該區(qū)抗原在肺結(jié)核疫苗研制方面的價(jià)值有一定報(bào)道[26]，RD11區(qū)Rv3245與Rv3428c編碼的重組蛋白均能夠引起小鼠γ-干擾素水平表達(dá)升高，表明Rv3428c抗原在結(jié)核病的診斷中也具有一定研究價(jià)值，可以作為融合抗原用于肺結(jié)核疫苗的研制[27-30]。本研究結(jié)果顯示，3組受試者中A組血清中Rv3428c表達(dá)水平最高，其次為B組，C組水平表達(dá)最低；進(jìn)一步繪制ROC曲線，以B組作為對照，驗(yàn)證其用于菌陰肺結(jié)核輔助診斷的效能，結(jié)果顯示Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰肺結(jié)核的曲線下面積為0.829，cut-off值為48 500.50，在該cut-off值下，Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰性肺結(jié)核的靈敏度和特異度分別為81.5%和82.0%，曲線下面積與特異度均處于較高水平，提示Rv3428c輔助診斷菌陰肺結(jié)核有著較高的應(yīng)用價(jià)值。但是目前國內(nèi)外關(guān)于結(jié)核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白用于輔助診斷菌陰肺結(jié)核的研究報(bào)道較少，故本研究結(jié)論尚沒有循證醫(yī)學(xué)相關(guān)的證據(jù)支持，還應(yīng)在未來開展大樣本、長時(shí)間的研究中加以驗(yàn)證。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白用于菌陰肺結(jié)核的輔助診斷有著較高的特異度與靈敏度，具有一定的臨床應(yīng)用的價(jià)值。