宋瑤琳 紀(jì)彬彬 劉相蘭 楊平 王博 梁樂彬 王愛蘭 楊家亮 田埂 邢曉明

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266021； 2 元碼基因科技(北京)股份有限公司； 3 煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院病理科)

胰腺癌是高度致死性的惡性腫瘤之一，死亡率居全球第四。大多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)已無法通過手術(shù)切除病灶，治療的中位生存期僅6～9個(gè)月，5年生存率低于5%，而行手術(shù)治療后患者的生存率也不足25%。因此，胰腺癌的診療是目前面臨的主要挑戰(zhàn)之一[1-2]。盡管全球范圍內(nèi)已針對(duì)胰腺癌進(jìn)行了數(shù)十年的基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究，但僅有極少數(shù)新療法進(jìn)入了臨床批準(zhǔn)階段[3]。胰腺癌患者的不良預(yù)后主要?dú)w因于胰腺癌細(xì)胞的快速轉(zhuǎn)移，因此了解胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的遺傳分子機(jī)制，對(duì)于進(jìn)行有效的靶向治療至關(guān)重要。

近年來，下一代測(cè)序技術(shù)在胰腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究中廣泛應(yīng)用[4]，在揭示胰腺癌的遺傳基礎(chǔ)、基因突變和發(fā)現(xiàn)新的驅(qū)動(dòng)基因方面發(fā)揮了重要作用。識(shí)別胰腺癌體細(xì)胞突變和臨床特征之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤基因組生物標(biāo)記物，有利于對(duì)患者進(jìn)行更加精準(zhǔn)治療[5-6]。本研究應(yīng)用胰腺導(dǎo)管癌(PDAC)患者的腫瘤組織進(jìn)行外顯子組測(cè)序，并應(yīng)用COSMIC數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證體細(xì)胞單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，評(píng)估依靠單樣本測(cè)序數(shù)據(jù)識(shí)別致癌體細(xì)胞突變的可行性；同時(shí)，分析鑒定致癌體細(xì)胞突變與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與外顯子組測(cè)序

收集2009—2011年在青島大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的PDAC患者的腫瘤組織樣本40例，患者術(shù)前均未接受過放療以及化療治療。該研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(審批號(hào)QDFY WZLL 26052)，并嚴(yán)格按照《人類和動(dòng)物權(quán)利聲明》以及《赫爾辛基宣言》執(zhí)行。 40例患者當(dāng)中男22例，女18例；年齡43～80歲，其中43～60歲者18例，61～80歲者22例；發(fā)病部位于胰體/胰尾者20例，胰頭者20例；臨床分期Ⅰ期者7例，Ⅱ期者18例，Ⅲ期者5例，Ⅳ期者10例；腫瘤組織高分化者2例，中分化者15例，低分化者23例。根據(jù)不同臨床特征將樣本分為不同的亞組：按照腫瘤分期分為Ⅰ/Ⅱ期組和Ⅲ/Ⅳ期組2個(gè)亞組；高分化組僅有2例，無統(tǒng)計(jì)意義，因此本研究按照腫瘤組織分化程度分為中、低分化組2個(gè)亞組。

取PDAC患者的腫瘤組織樣本甲醛固定并石蠟包埋，通過QIAamp DNA試劑盒(Qiagen公司，美國(guó))提取基因組DNA并進(jìn)行片段化處理后，構(gòu)建DNA測(cè)序文庫，并與安捷倫人類全外顯子靶向富集V1(Agilent Technologies，美國(guó))雜交，得到捕獲產(chǎn)物，純化后用以擴(kuò)增形成全外顯子組。再通過Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))和Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies，美國(guó))對(duì)全外顯子組進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后于Illumina NovaSeq(Illumina，美國(guó))測(cè)序儀上進(jìn)行150個(gè)堿基末端配對(duì)測(cè)序，測(cè)序深度為77～251X，平均深度為153X，獲得樣本中的外顯子組結(jié)果。

1.2 致癌體細(xì)胞突變分析

1.2.1致癌體細(xì)胞突變篩選 將Illumina測(cè)序堿基質(zhì)量值轉(zhuǎn)換為Sanger標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序堿基質(zhì)量值，默認(rèn)算法為Burrows-Wheeler Aligner(BWA)算法(版本0.7.0)，將測(cè)序結(jié)果與人類參考基因組(Hg19)進(jìn)行比對(duì)，并過濾掉比對(duì)到基因組多處的序列。然后，應(yīng)用基因組分析工具包(GATK)和Maftools R包對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為提高致癌體細(xì)胞突變檢測(cè)結(jié)果的可信度，首先通過COSMIC數(shù)據(jù)庫(突變均來自于體細(xì)胞)過濾并下載VCF文件，過濾條件如下：將注釋為COSMIC癌癥體細(xì)胞突變目錄數(shù)據(jù)庫包含的常見SNP或非編碼基因變異過濾掉；然后再通過隱馬爾可夫模型的功能分析工具進(jìn)一步過濾掉FATHMM數(shù)據(jù)庫中沒有標(biāo)注為致病性的突變；最后過濾掉突變比率低于5%或唯一比對(duì)但序列數(shù)量小于10的變異。最終剩余的數(shù)據(jù)用于致癌體細(xì)胞突變分析。

1.2.2TCGA突變數(shù)據(jù)比較 在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載PDAC臨床測(cè)序數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的臨床資料，并應(yīng)用MuTect2軟件生成突變注釋格式(MAF)文件。MAF文件中的致癌體細(xì)胞突變過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：測(cè)序深度≥10，突變比率≥5%，突變類型設(shè)定為錯(cuò)義突變、同義突變，SIFT選擇有害，生物類型選擇蛋白編碼，ExAC_AF<1%，F(xiàn)ILTER選擇PASS；臨床資料的過濾標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為：腫瘤病理類型為PDAC，腫瘤發(fā)病部位包括胰頭、胰體或胰尾。

1.3 PDAC腫瘤組織樣本基因突變的通路分析及基因突變互斥性與共現(xiàn)性分析

按照協(xié)同和互斥的表現(xiàn)形式，將突變模式分為共現(xiàn)性和互斥性。使用MAFtools函數(shù)somatic Interactions對(duì)選中的基因突變兩兩之間進(jìn)行Fisher檢驗(yàn)，分析基因突變的共現(xiàn)性。在進(jìn)行互斥性分析時(shí)，同時(shí)對(duì)基因兩兩之間進(jìn)行分析，按照有無突變構(gòu)建2×2的列聯(lián)表，并采用CoMEt(Combinations of Mutually Exclusive Alterations)確定腫瘤中相互排斥變化組合的統(tǒng)計(jì)方法,CoMEt包括針對(duì)互斥性的精確統(tǒng)計(jì)測(cè)試，以及對(duì)多組互斥和特定于子類型的變更進(jìn)行同時(shí)分析的技術(shù)，通過CoMEt檢驗(yàn)法計(jì)算顯著性，可以尋找包含>2基因的互斥基因集。

1.4 PDAC腫瘤組織的基因突變與臨床病理特征關(guān)系分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫分析PDAC腫瘤組織樣本基因突變的數(shù)量和百分比，通過費(fèi)舍爾提取測(cè)試方法分析臨床特征各亞組與基因突變之間的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Python軟件完成統(tǒng)計(jì)與分析，通過χ2檢驗(yàn)分析臨床特征各亞組與基因突變之間的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDAC腫瘤組織樣本的全外顯子組測(cè)序結(jié)果

40例PDAC腫瘤組織樣本共發(fā)現(xiàn)1 446處致癌體細(xì)胞突變位點(diǎn)，涉及759個(gè)基因，每例樣本包含25～82處致癌體細(xì)胞突變位點(diǎn)。PDAC腫瘤組織樣本的檢測(cè)平均覆蓋率為99.2%，PDAC腫瘤組織樣本產(chǎn)生的高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度平均為15.8×109bp，可與人類參考基因組序列唯一比對(duì)的堿基序列占比為84.3%。

2.2 PDAC腫瘤組織樣本中致癌體細(xì)胞突變類型分析和突變譜鑒定

對(duì)PDAC腫瘤組織樣本中致癌體細(xì)胞的突變類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，樣本體細(xì)胞突變類型中構(gòu)成比占前3位的分別為C>A突變、C>T突變、T>A突變，分別占48%、45%、6%，每例樣本中均包含有上述3種類型基因突變，其中堿基顛換(Tv)的構(gòu)成比為 56.8%，堿基轉(zhuǎn)換(Ti)的構(gòu)成比為 43.2%。

在發(fā)現(xiàn)的致癌體細(xì)胞突變中，每個(gè)PDAC腫瘤組織樣本平均有38個(gè)錯(cuò)義突變，2個(gè)同義突變(圖1A)；在1 446處致癌體細(xì)胞突變中對(duì)突變的體細(xì)胞進(jìn)行分析，排名前10位的突變基因名稱及其百分比如圖1B所示。本研究對(duì)PDAC的腫瘤分期的每個(gè)樣本的平均突變數(shù)量進(jìn)行分析，其中PDAC臨床分期為Ⅰ期的突變數(shù)量為42個(gè)，Ⅱ期為40個(gè)，Ⅲ期為37個(gè)，Ⅳ期為42個(gè)，致癌體細(xì)胞突變的數(shù)量在腫瘤的不同分期中無顯著差異(圖1C)。TCGA數(shù)據(jù)庫中PDAC致癌體細(xì)胞突變的平均數(shù)量為45個(gè)，本研究中的PDAC樣本測(cè)序數(shù)據(jù)集中在40個(gè)左右的范圍，總體和TCGA數(shù)據(jù)庫中PDAC測(cè)序數(shù)據(jù)相符，突變數(shù)量與TCGA數(shù)據(jù)庫相比，分布更為集中(圖1D)。

A：錯(cuò)義突變和同義突變數(shù)量的箱線圖；B：突變百分比前10位基因的名稱及其百分比；C：不同腫瘤分期的體細(xì)胞突變情況比較；D：TCGA數(shù)據(jù)庫中不同類型腫瘤的致癌體細(xì)胞突變數(shù)量分布圖，其中灰色點(diǎn)表示突變數(shù)量的范圍，紅色線表示突變數(shù)量的平均數(shù)

2.3 PDAC腫瘤組織樣本中突變基因的相關(guān)信號(hào)通路分析及基因突變互斥性、共現(xiàn)性分析

本研究針對(duì)單個(gè)PDAC腫瘤組織樣本突變精準(zhǔn)研究結(jié)果如圖2A所示，其中每列代表一個(gè)樣本，綠色和紅色標(biāo)記相應(yīng)的突變位點(diǎn)和突變總數(shù)量，單個(gè)樣本包含的突變數(shù)量為40個(gè)左右，其中1個(gè)樣本突變數(shù)量為82個(gè)，同一樣本中同時(shí)含有KRAS與TTN基因雙突變的數(shù)量最多，KRAS與RLIM基因雙突變的頻率排名第二，而在不含有KRAS基因突變的樣本中，高雙突變樣本多包含RLIM基因突變，同時(shí)本樣本中同義突變集中于TP53和TTN基因。對(duì)PDAC腫瘤組織樣本中突變基因的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析，顯示涉及到的信號(hào)通路共10個(gè)，分別為7tm_1、 FN3、 Cadherin、 WD40、LIC、COG1100、PDZ_signaling、 COG5048、 PTZ00018、 DUF3512通路，其中7tm_1、 FN3及Cadherin通路是突變位點(diǎn)富集較多的通路(圖2B)。

A：?jiǎn)蝹€(gè)PDAC腫瘤組織樣本中體細(xì)胞突變百分比排名前10位的基因突變分析；B：信號(hào)通路分析中相關(guān)基因的突變情況，紅色的圓點(diǎn)為生物學(xué)信號(hào)通路，對(duì)應(yīng)X軸為該信號(hào)通路中出現(xiàn)的基因突變數(shù)量，對(duì)應(yīng)的Y軸以及圓點(diǎn)的大小為與該信號(hào)通路有關(guān)的基因數(shù)量，圓點(diǎn)越靠右上方表示基因突變位點(diǎn)的數(shù)量和基因數(shù)量越多

本研究結(jié)果顯示，在PDAC中不同基因之間存在著基因互斥性和共現(xiàn)性的現(xiàn)象，如BMS1基因可以與OR4K5、COL6A3、BPGRIP1L、CEP170B、MAP1B、CDC27基因發(fā)生共突變，CDC27基因可以與OR4K5、COL6A3、BPGRIP1L、CEP170B以及MAP1B基因發(fā)生共突變；MAP1B基因可與OR4K5、COL6A3、BPGRIP1L、CEP170B基因發(fā)生共突變(圖3A)。相反的，某些基因突變間存在互斥性的現(xiàn)象，如RLIM基因與OR4K5、COL6A3、CEP170B以及BDR9存在突變互斥。由于基因KRAS和RLIM突變研究的結(jié)果較多，本研究主要對(duì)TTN基因突變位點(diǎn)以及氨基酸方面的改變進(jìn)行研究，TTN基因突變位點(diǎn)共有10處，其中在3例樣本當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了6處突變位點(diǎn)，均為C>T點(diǎn)的突變(c.53359C>T、c.53734C>T、c.53935C>T、c.72850C>T、c.75631C>T、c.80554C>T)，在氨基酸層面上均為精氨酸到半胱氨酸(R>C)的改變(p.R17787C、p.R17912C、p.R17979C、p.R24284C、p.R25211C、p.R26852C)，進(jìn)一步結(jié)合患者的臨床特征，顯示這3例樣本均來自于低分化組亞組。TTN基因的全部突變點(diǎn)如圖3B所示，突變熱點(diǎn)聚集在lg_Semaphorin_C、lg_Titin_like結(jié)構(gòu)域，而且僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)同義突變，其余均為錯(cuò)義突變。

A：基因共突變和互斥突變的分布圖；B：TTN基因上的突變位點(diǎn)，Y軸表示每個(gè)位點(diǎn)的突變頻次

2.4 PDAC腫瘤組織樣本中基因突變與患者臨床特征的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，不同腫瘤分化程度的患者ASTN1基因突變情況比較差異有顯著意義(χ2=6.855,P<0.05)；不同腫瘤分期患者TTN基因突變情況比較差異有顯著性(χ2=5.183，P<0.05)。見表1。

表1 PDAC腫瘤組織樣本中ASTN1、TTN基因突變與患者臨床特征的關(guān)系

3 討 論

目前，胰腺腫瘤性病變中體細(xì)胞突變與患者臨床特征間關(guān)系的研究已有報(bào)道，但該研究?jī)H局限于50個(gè)胰腺癌相關(guān)的基因[7]。以往研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中存在多種致癌體細(xì)胞的突變，這些突變會(huì)影響關(guān)鍵致癌驅(qū)動(dòng)基因以及腫瘤抑制基因，包括KRAS、TP53、CDKN2A以及SMAD4基因等，而目前尚不清楚哪些突變是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的突變[8-9]。因此，利用全外顯子測(cè)序結(jié)果分析胰腺癌體細(xì)胞突變和臨床特征之間的關(guān)系是必要的，從而前瞻性地指導(dǎo)患者的治療[10]。

通常，病理醫(yī)生判斷腫瘤患者的某一突變?yōu)轶w系突變還是胚系突變時(shí)，需要同一患者來源的腫瘤與非腫瘤組織的NGS測(cè)序數(shù)據(jù)。在多種腫瘤的體細(xì)胞突變研究中多使用配對(duì)組織分析方法，其中TCGA為常見的泛腫瘤數(shù)據(jù)庫，包含了多種類型的腫瘤與瘤旁樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)[11]。然而，在臨床及實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中有時(shí)難以獲取配對(duì)的瘤旁樣本，特別是在回顧性研究中，通常會(huì)缺乏與石蠟包埋的腫瘤樣本配對(duì)的非腫瘤樣本，因此僅應(yīng)用腫瘤樣本分析體細(xì)胞突變的研究目前比較多[12-17]。

本研究采用的是全外顯子測(cè)序的方法，通過與COSMIC數(shù)據(jù)庫中的SNP進(jìn)行比對(duì)用以鑒別入組的PDAC樣本中致癌體細(xì)胞的突變情況，結(jié)果在40例PDAC腫瘤組織樣本的759個(gè)基因中，總共檢測(cè)出1 446個(gè)致癌體細(xì)胞突變位點(diǎn)，每例樣本中發(fā)現(xiàn)有25～82個(gè)致癌體細(xì)胞突變位點(diǎn)，與之前所發(fā)表的PDAC腫瘤組織中平均有48個(gè)致癌體細(xì)胞突變位點(diǎn)的結(jié)論相符合[18]。眾所周知，KRAS基因的致癌突變是PDAC發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因素，本研究結(jié)果也表明KRAS基因體細(xì)胞突變發(fā)生頻率最高。這些結(jié)果與以往的研究報(bào)道一致，驗(yàn)證了本研究方法對(duì)腫瘤樣本分析的有效性[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，PDAC腫瘤組織中的RLIM、TTN和BRD9基因突變發(fā)生的百分比僅次于KRAS基因，表明這些基因在PDAC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[21]。RLIM/RNF12基因編碼一種含RING域的E3泛素連接酶，通過負(fù)調(diào)控c-Myc轉(zhuǎn)錄活性來抑制細(xì)胞增殖，并通過消除MDM2介導(dǎo)的P53降解和泛素化來穩(wěn)定TP53蛋白[22]。此外，RLIM蛋白已被證實(shí)在乳腺癌發(fā)生過程中調(diào)節(jié)雌激素依賴性轉(zhuǎn)錄和雌激素受體的生物活性，也有研究表明RLIM可通過誘導(dǎo)P15和P21蛋白而抑制肝細(xì)胞癌變[23]。這些研究成果為RLIM基因在癌癥生物學(xué)中的關(guān)鍵作用提供了更多證據(jù)，但目前針對(duì)RLIM基因與PDAC的報(bào)道較少。編碼titin蛋白的TTN基因在脊椎動(dòng)物橫紋肌正常生理功能中具有重要作用，而在原發(fā)性胰腺癌和PDAC中TTN基因均有頻繁突變[24-25]。IZUMI等[15]對(duì)一組纖維肌病患者進(jìn)行了連鎖分析以及外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)c.90263G>T(NM_001256850)為一新的TTN基因突變。MIHAILOV等[16]分析了3例腹股溝疝患者的家族成員的全外顯子測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的TTN基因c.88880A>C雜合錯(cuò)義突變。這些都表明，TTN基因在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用。同時(shí)，在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中BRD9基因突變檢出百分比較高，該基因編碼含溴結(jié)構(gòu)域蛋白9的表達(dá)，是SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體的一個(gè)組成蛋白[26]。本研究通過對(duì)PDAC腫瘤組織相關(guān)信號(hào)通路基因的突變分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與PDAC相關(guān)的重要信號(hào)通路。此外，本研究分析了基因突變的互斥性和共現(xiàn)性，確定基因之間潛在的相互作用，可以更好地指導(dǎo)臨床靶向、化療和免疫治療等。

腫瘤組織中已存在的某個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變會(huì)影響其他驅(qū)動(dòng)基因的突變，這種現(xiàn)象被稱為驅(qū)動(dòng)基因的互斥性。與互斥模式相反,驅(qū)動(dòng)基因間也會(huì)存在協(xié)同模式,兩個(gè)協(xié)同的驅(qū)動(dòng)突變往往同時(shí)發(fā)生,共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，這種現(xiàn)象被稱為共突變。在進(jìn)行突變分析時(shí)確定腫瘤組織中基因突變潛在的相互作用，可以更好地了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，從而更好地指導(dǎo)臨床用藥。本研究結(jié)果表明，PDAC腫瘤組織樣本中BMS1、CDC27、MAP1B基因共突變的可能性較高，即如果樣本中BMS1基因發(fā)生突變，則CDC27和MAP1B基因也極可能發(fā)生突變。相反的，某些基因突變間存在互斥，例如RLIM基因與OR4K5、COL6A3、CEP170B、BDR9存在突變互斥，即在一個(gè)樣本中如果發(fā)生RLIM基因突變，則OR4K5、COL6A3、CEP170B、BDR9基因幾乎不會(huì)發(fā)生突變。

本研究結(jié)果亦顯示，在PDAC患者Ⅲ/Ⅳ期組中TTN基因突變顯著富集，提示TTN與高分期PDAC密切相關(guān)[27-28]。但是，TTN基因突變與腫瘤的分化程度之間沒有關(guān)系，提示晚期富集突變不是由腫瘤分化程度所引起。遺憾的是，TCGA數(shù)據(jù)庫中與本研究中Ⅲ/Ⅳ期患者對(duì)應(yīng)的樣本的數(shù)量太少，無法驗(yàn)證富集程度，因此本研究沒有進(jìn)行進(jìn)一步的分析。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，ASTN1基因突變與腫瘤的分化程度有關(guān)，而與腫瘤分期無關(guān)。同時(shí)，KRAS、TP53、SMAD4及CDKN2A基因突變與所分析的臨床特征沒有明顯的關(guān)系，與先前研究報(bào)道結(jié)果一致[29-30]。

本研究仍存在一些局限性。首先，本研究使用的應(yīng)用COSMIC數(shù)據(jù)庫中的變異SNP擬合方法鑒定腫瘤組織中致癌體細(xì)胞突變，雖可以有效識(shí)別體細(xì)胞突變，但缺少匹配的非腫瘤樣本，致使通過全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定PDAC體細(xì)胞突變?nèi)狈θ嫘?；其次收集的腫瘤樣本量較少。綜上所述，本研究揭示了PDAC中體細(xì)胞突變與患者臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了胰腺癌組織中KRAS、RLIM、TNN等基因突變頻率高，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了與高頻突變基因相關(guān)的信號(hào)通路FN3。另外，本研究表明BMS1、CDC27、MAP1B基因共突變概率較高，而RLIM基因與OR4K5、COL6A3、CEP170B、BDR9基因存在突變互斥現(xiàn)象。最后本研究還闡明了TTN和ASTN1基因突變與腫瘤分化程度以及腫瘤分期的關(guān)系，為PDAC患者的精準(zhǔn)治療提供了一定的理論參考依據(jù)。