郭瑩，李景輝，李霄霄，李研科，王國(guó)明，尹翠娟，張翠英*

（1.省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.河北山莊老酒股份有限公司，河北 承德 067500）

中國(guó)白酒有悠遠(yuǎn)的歷史，多以小麥、高粱、玉米、大米和豌豆等糧食作物為主要原料，經(jīng)過制曲、蒸梁、拌料、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵以及蒸酒等主要生產(chǎn)過程釀造而成[1]。環(huán)境中紛繁復(fù)雜的微生物類群經(jīng)自然網(wǎng)羅進(jìn)入釀酒基質(zhì)體系，最終由發(fā)酵代謝出以乙醇為主體的品類繁多的有機(jī)化合物成分，賦予中國(guó)白酒特有的“香和味”[2]。白酒種類繁多，因香型差異可以將其劃分為清香型、濃香型、醬香型、米香型和其它各類香型。白酒是我國(guó)一種獨(dú)特的蒸餾酒，其釀造風(fēng)格、口味獨(dú)特，且全球聞名，與世界其它著名蒸餾酒（如白蘭地、威士忌、朗姆酒等）齊名成為六大蒸餾酒之一[3]。

徐巖等[4-5]通過研究證明，中國(guó)白酒不等同于酒精，而是含有各類醇、醛、酸、酯等豐富的風(fēng)味物質(zhì)且具保健功能的混合飲品。此外，有研究[6-7]報(bào)導(dǎo)中國(guó)白酒對(duì)心腦血管疾病有保護(hù)作用，亦能提升機(jī)體抵抗氧化損傷的能力，同時(shí)阻止體內(nèi)代謝不良產(chǎn)物的生成，這進(jìn)一步證實(shí)了中國(guó)白酒具有保健功效。白酒的生產(chǎn)經(jīng)歷了多種微生物的混合發(fā)酵過程，在這一過程中，微生物會(huì)代謝產(chǎn)生各種功能成分，如四甲基吡嗪、γ-氨基丁酸和核苷類物質(zhì)等[7]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）具有保護(hù)心血管功能、降低血壓、抗癲癇、鎮(zhèn)痛以及痛覺過敏等作用[8-11]，是有益于機(jī)體健康的氨基酸之一。此外，γ-氨基丁酸對(duì)胰島β細(xì)胞能發(fā)揮保護(hù)和再生作用，還可以促進(jìn)腦細(xì)胞的新陳代謝與恢復(fù)，增強(qiáng)長(zhǎng)期記憶[12-13]，還具有提高肝、腎機(jī)能等生理活性的功能[14]。核苷類化合物具有補(bǔ)益和增強(qiáng)免疫、保護(hù)神經(jīng)、抗氧化、抗癌等生物活性，研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，腺苷能顯著提高細(xì)胞活力，并在機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。尿苷具有促進(jìn)睡眠和抗癲癇的作用，能改善記憶功能，影響神經(jīng)元可塑性。

高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，該方法已廣泛用于生物發(fā)酵中各種成分含量的測(cè)定，且使用的流動(dòng)相簡(jiǎn)單并具有良好的重現(xiàn)性[17-18]。本研究采用高效液相色譜法，通過對(duì)色譜檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立以高效液相色譜法定量分析中國(guó)白酒中γ-氨基丁酸和核苷類物質(zhì)（腺苷、尿苷）的有效方法，并用所建方法對(duì)20種白酒中的上述功能成分進(jìn)行了檢測(cè)與分析，為進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化中國(guó)白酒的品質(zhì)評(píng)價(jià)及開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)中國(guó)白酒的生產(chǎn)改良、市場(chǎng)推廣和深入科學(xué)研究有積極的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

待測(cè)酒樣共20個(gè)，1號(hào) ～9號(hào)白酒為河北山莊老酒；10號(hào) ～20號(hào)白酒為市售酒樣。γ-氨基丁酸、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、丹磺酰氯（（純度均＞99%）、尿苷（純度≥98%）：美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津一方科技有限公司；乙酸鈉、碳酸氫鈉（分析純）：天津索羅門生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；EDAA-2300TH超聲波清洗器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；BSA224S電子分析天平：愛來寶醫(yī)療科技有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋：上海一凱儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取GABA的標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成100 mg/L的γ-氨基丁酸標(biāo)樣母液。隨后倍比稀釋，配制成 0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

核苷類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：精確稱取尿苷的標(biāo)準(zhǔn)品1.00mg和腺苷的標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg置于同一10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶解并定容，可得尿苷濃度為100 mg/L和腺苷濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)樣母液。倍比稀釋即可得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中尿苷溶度為0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L；腺苷濃度為 5、10、20、50、100 mg/L。

1.3.1.2 樣品溶液的配制

測(cè)定γ-氨基丁酸：測(cè)定前需對(duì)樣品衍生化處理，準(zhǔn)確吸取1 mL的酒樣或標(biāo)準(zhǔn)溶液置于具塞試管中，加入0.20 mL的碳酸氫鈉溶液和0.40 mL的丹磺酰氯衍生試劑，混勻后在70℃水浴中反應(yīng)20 min，用0.22 μm的微孔濾膜過濾后待測(cè)。

測(cè)定核苷類物質(zhì)：取2 mL酒樣用0.22 μm的微孔濾膜過濾后待測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)方法

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)γ-氨基丁酸的流動(dòng)相A為乙腈，B為50 mmol/L三水合乙酸鈉；檢測(cè)核苷類物質(zhì)流動(dòng)相A為甲醇，B為水，具體色譜條件見表1。

表1 色譜條件Table 1 The chromatographic conditions

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取1.3.1.1中的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在1.3.2相應(yīng)的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度（C）為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)峰面積值（S）為縱坐標(biāo)，分別建立γ-氨基丁酸和核苷類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度試驗(yàn)

取0.50 mg/L的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品和核苷類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品（尿苷：1.00 mg/L；腺苷：10.00 mg/L）各6份，分別在1.3.2相應(yīng)的色譜條件下測(cè)定含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取2號(hào)酒樣分別添加0.5、1.0、2.0 mg/L的3種濃度的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，隨后衍生化處理；另取2號(hào)酒樣添加尿苷濃度分別為1、2、5 mg/L，腺苷濃度分別為10、20、50 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以上加標(biāo)樣品均用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，在1.3.2相應(yīng)的色譜條件下重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件Agilent Chem－Station進(jìn)行處理。所有線性方程、精密度及回收率試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Office Excel 2016處理得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

γ-氨基丁酸色譜條件的優(yōu)化：通過對(duì)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸在436 nm處具有最大吸收峰，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為436 nm。本試驗(yàn)分別采用50%、55%、60%、65%、70%、75%這6種比例的流動(dòng)相B進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相B為65%時(shí)，γ-氨基丁酸的峰型對(duì)稱，基線穩(wěn)定。當(dāng)流速由0.6 mL/min逐漸遞增到1.2 mL/min時(shí)，γ-氨基丁酸的峰均能分離，但峰保留時(shí)間變短且柱壓出現(xiàn)波動(dòng)式變化，使得峰型較差。當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，柱壓穩(wěn)定，色譜峰保留時(shí)間未發(fā)生偏移且峰型最佳。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在4種不同的柱溫條件下，γ-氨基丁酸的分離效果均較好，說明柱溫對(duì)其影響較小。綜合峰型、對(duì)色譜柱的保護(hù)和柱壓穩(wěn)定性的因素，確定了最佳色譜檢測(cè)條件：進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相A∶B=35∶65（體積比），流速為1.0mL/min，柱溫 40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為436 nm。該色譜條件下γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 The GABA standard solution chromatogram

由圖1可知，GABA的保留時(shí)間為5.321 min。

核苷類物質(zhì)檢測(cè)色譜條件的優(yōu)化：查閱測(cè)定核苷類物質(zhì)的相關(guān)文獻(xiàn)[19]，確定色譜檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；本試驗(yàn)分別采用10%、20%、30%、40%、50%這5種甲醇濃度的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇濃度的升高，腺苷、尿苷與樣品中其他組分的分離度降低，出現(xiàn)峰分裂和小峰的現(xiàn)象。當(dāng)甲醇濃度為10%時(shí)，樣品中腺苷、尿苷的峰型良好，分離度高，且無拖尾現(xiàn)象。另外，本文考察了0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 這 4 種流速下的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這4種流速下，腺苷和尿苷都完全分離，流速增大雖改善了標(biāo)準(zhǔn)色譜峰與雜質(zhì)峰的分離度，但流速過高會(huì)使峰形變差，柱壓顯著波動(dòng)。發(fā)現(xiàn)柱溫在30℃到50℃之間對(duì)色譜峰型與分離效果無明顯影響。綜合上述結(jié)果，確定了最佳色譜檢測(cè)條件：進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相10%甲醇，體積流量為0.8 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。該色譜條件下核苷類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2?？芍?，尿苷、腺苷的保留時(shí)間分別為 4.191、11.625 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將γ-氨基丁酸的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液以及尿苷和腺苷的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在2.1的色譜條件下測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（C），標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)（S），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表2。

圖2 核苷類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 The two nucleoside substances standard solution chromatogram

表2 回歸曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 2 The standard curve，correlation index，linearity range

由表2可知，所測(cè)物質(zhì)線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.995。采用此方法γ-氨基丁酸在0.1mg/L ～20 mg/L具有良好的線性，尿苷在0.5 mg/L ～100 mg/L具有良好的線性，腺苷在5 mg/L ～1 000 mg/L具有良好的線性，完全滿足試驗(yàn)要求。

2.3 精密度試驗(yàn)

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得γ-氨基丁酸、腺苷和尿苷含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，結(jié)果見表3和表4。

表3 γ-氨基丁酸精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of GABA precision detection（n=6）

由表3和表4可知，γ-氨基丁酸的RSD值為2.37%，尿苷的RSD為1.76%，腺苷的RSD為1.99%，均＜5%，可見此法的精密度良好，滿足分析要求。

2.4 加標(biāo)回收率

γ-氨基丁酸和核苷類物質(zhì)的加標(biāo)回收率結(jié)果分別見表5和表6。

由表5和表6可知，GABA加標(biāo)回收率在97.93% ～99.72%之間，核苷類物質(zhì)回收率在97.90% ～101.15%，RSD均<5.0%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，可以滿足測(cè)定的要求。

表4 核苷類物質(zhì)精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 Results of nucleoside substances precision detection（n=6）

表5 GABA加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 5 Results ofGABA adding standard recovery rate tests（n=3）

表6 核苷類物質(zhì)加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 6 Results of nucleoside substances adding standard recovery rate tests（n=3）

2.5 樣品測(cè)定

應(yīng)用2.1確定的色譜條件對(duì)20種白酒進(jìn)行測(cè)定見表7。

γ-氨基丁酸在20種白酒中的含量在0.102 mg/L ～0.867mg/L之間，其中醬香型白酒的含量在0.143 mg/L ～0.188 mg/L之間，濃香型白酒的含量在0.102 mg/L ～0.867 mg/L之間，芝麻香型白酒和部分醬香型白酒中未檢測(cè)到。李波等[20]發(fā)現(xiàn)GABA在發(fā)酵過程中可以作為酵母的氮源被酵母很好的利用。部分白酒中未檢測(cè)到GABA，可能是由于在發(fā)酵過程中被消耗，進(jìn)而未檢測(cè)出。此外，1號(hào) ～9號(hào)白酒中濃香型白酒GABA的含量在0.239 mg/L ～0.867 mg/L之間，高于醬香型白酒，同時(shí)也高于大部分市售酒樣。2號(hào)濃香型白酒中GABA的含量最高，達(dá)到0.867 mg/L，其次為1號(hào)酒樣達(dá)到0.659 mg/L。因2號(hào)樣品儲(chǔ)存時(shí)間相比其他樣品久，在本次試驗(yàn)中，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，GABA的含量越高。但儲(chǔ)存時(shí)間的長(zhǎng)短與GABA的含量之間是否有一定的規(guī)律性還需進(jìn)行大量試驗(yàn)驗(yàn)證。

表7 樣品測(cè)定結(jié)果Table 7 The results of samples

酒樣中核苷類成分檢測(cè)率為100%，檢測(cè)到20種白酒中腺苷的含量在10.043 mg/L ～433.460 mg/L之間，尿苷的含量在0.580 mg/L ～8.657 mg/L之間。相比于醬香型和濃香型白酒，芝麻香型白酒中腺苷的含量較高，9號(hào)達(dá)到433.460 mg/L。醬香型白酒中尿苷含量最高，4號(hào)達(dá)到8.657 mg/L；其次為芝麻香型白酒，濃香型白酒含量最低。測(cè)定結(jié)果表明，該酒廠中醬香型（4號(hào) ～6號(hào)）和芝麻香型（8號(hào)、9號(hào)）白酒中這兩種核苷類物質(zhì)含量高于市售酒樣，而濃香型白酒（1號(hào) ～3號(hào)）則與市售酒樣相差不大。

可見，不同香型酒之間GABA和核苷類物質(zhì)的含量均存在差異。研究報(bào)道[21-23]，釀造工藝（如原料、酒曲等）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中GABA的含量影響顯著。不同香型白酒釀造工藝不同，各地氣候、環(huán)境及微生物的差異很大，但釀造工藝是如何使得不同白酒中GABA、核苷類物質(zhì)在含量上產(chǎn)生以上差異還需要進(jìn)一步探究。核苷類物質(zhì)含量差異與制曲、堆積工藝等關(guān)系也需進(jìn)一步的研究。因此，采用簡(jiǎn)便快捷的方法測(cè)定白酒中的GABA和核苷類物質(zhì)，對(duì)未來探究不同香型白酒中GABA和核苷類物質(zhì)差異原因有著重要意義。

3 結(jié)論

本文建立利用高效液相色譜法精確測(cè)定白酒中GABA以及核苷類物質(zhì)（尿苷、腺苷）的方法，并對(duì)20種白酒其功能成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同種類的白酒中含量不盡相同。20種白酒中GABA的含量在0.102 mg/L ～0.870mg/L之間，腺苷的含量在10.043mg/L ～433.460mg/L之間，尿苷的含量在0.580 mg/L ～8.657 mg/L之間。分析結(jié)果顯示，GABA在濃香型白酒中較高，核苷類物質(zhì)在芝麻香型和醬香型白酒中要高于濃香型白酒。本研究通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化以及對(duì)精密度、回收率的測(cè)定，充分證明了試驗(yàn)的可行性，具有較高的參考價(jià)值。本文建立的方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，適用范圍廣，適用于大量樣本的測(cè)定，為后期探索功能成分合成機(jī)制以及釀造工藝如何影響其在白酒中的含量奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。