張孟歷，張宏武，賈紅梅，于猛，王寶龍，鄒忠梅*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3.中國(guó)質(zhì)量萬里行促進(jìn)會(huì)生態(tài)蜂業(yè)專業(yè)委員會(huì)，北京 100031）

蜂蜜是由蜜蜂科昆蟲意大利蜜蜂（Apis mellifera Ligustica.）及中華蜜蜂（Apis cerana cerana Fabricius）吸收植物花粉，與自身分泌物結(jié)合后，在蜂巢中存放釀造而形成的天然甜物質(zhì)[1-2]，是公認(rèn)的具有多種生物活性的天然食品。蜂蜜作為藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱蜂蜜為藥中之上品，其中記載“蜂蜜味甘、平，無毒，主心腹邪氣，諸驚癇痙，安五臟諸不足，益氣補(bǔ)中，止痛解毒，除百病和百藥。久服強(qiáng)志輕身，不饑不老，延年”[3-5]。

蜂蜜的品種常常由養(yǎng)蜂人根據(jù)蜂巢位置及其附近可用的花源進(jìn)行主觀判定，但對(duì)蜂蜜品種純度關(guān)注不多[6-9]。蜂蜜的純度直接影響蜂蜜的外觀、口感及生物活性。應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)如高效液相、核磁共振等可建立鑒別蜜源植物的方法，但花粉種類作為蜜源植物的判斷依據(jù)[10-12]仍然是最直觀的指標(biāo)。蜜蜂采集花蜜的同時(shí)，也會(huì)采集到蜜源植物的花粉，而每一種植物花粉都有自己特有的形態(tài)特征，因此根據(jù)蜂蜜中的花粉種類和數(shù)量可以鑒定蜂蜜的種類和質(zhì)量。通常認(rèn)為“某種花的花粉率大于50%定義為該蜜源植物的單花蜜，小于50%則為雜花蜜或百花蜜”[13]。

椴樹蜜是蜜蜂采集椴樹屬植物椴樹[紫椴（Tilia amurensis Rupr.）、糠椴（Tilia mandshurica Rupr.et Maxim）等]花蜜釀造而成的蜜，主產(chǎn)于完達(dá)山脈、大興安嶺、小興安嶺、長(zhǎng)白山脈及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，作為我國(guó)東北地區(qū)的特色蜜種，產(chǎn)量大且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。純正椴樹蜜色白偏黃，口感細(xì)膩，具有治療便秘、失眠、高血壓、支氣管炎等多種疾病的作用，也是肝臟疾病和神經(jīng)衰弱癥的良好輔助劑[14]。目前，對(duì)椴樹蜜的研究不多，主要集中在成分與活性相關(guān)報(bào)道，有報(bào)道顯示，椴樹蜜中含有黃酮等酚類成分，并顯示其有一定抗氧化活性[15-17]。但酚性成分含量、抗氧化活性是否與椴樹蜜純度具有相關(guān)性尚未見研究報(bào)道。因此，本文首先測(cè)定了來自東北地區(qū)且蜂農(nóng)認(rèn)定的椴樹蜜中椴樹花粉含量，鑒定椴樹蜜的純度，區(qū)分椴樹單花蜜與椴樹雜花蜜；通過福林酚法測(cè)定了椴樹單花蜜與椴樹雜花蜜總酚含量；并測(cè)定了椴樹單花蜜與椴樹雜花蜜的抗氧化活性，為椴樹蜜質(zhì)量評(píng)價(jià)及生物活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椴樹蜜，2018年從我國(guó)東北地區(qū)8位蜂農(nóng)處收集，共16批，詳細(xì)資料見表1。

表1 椴樹蜜樣品來源信息表Table 1 Source information of linden honey

1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基清除法，ABTS法）：Sigma公司；蒸餾水：屈臣氏；色譜甲醇（批號(hào)L-14834）：美國(guó)Fisher公司；甘油明膠（規(guī)格 10 mL，批號(hào) 20180925）：Solarbio公司；沒食子酸（批號(hào)030002710001，純度≥98%）：南京澤朗生物科技有限公司；無水碳酸鈉（批號(hào)20180118）：北京市通廣精細(xì)化工公司；福林酚試劑（批號(hào)SL28211620）：Coolaber公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（鐵離子還原能力法，F(xiàn)RAP法）：碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MSA125P-100-DU電子分析天平：德國(guó)SARTORIUS公司；KQ-500E超聲振蕩儀：昆山市超聲儀器有限公司；Axio Observer D1顯微鏡：德國(guó)ZEISS公司；SUNRISE型酶標(biāo)光度計(jì)：美國(guó)Tecan公司；UV-3100紫外-可見分光光度計(jì)：上海MAPADA公司。

1.3 方法

1.3.1 椴樹蜜花粉含量的測(cè)定

椴樹蜜花粉含量的測(cè)定參考張金振等[18]文獻(xiàn)里的方法稍作改變。提取方法：將蜂蜜樣品混勻后稱取2 g椴樹蜜，加水4 mL，混勻。2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再加4 mL水，2 000 r/min離心10 min。小心傾出上清液后，沉淀加200 μL水混勻備用，待制片用。制片：在40℃的水浴中液化甘油明膠，同時(shí)將載玻片和蓋玻片放置于40℃加熱板上預(yù)熱，分別吸取100 μL懸濁液于兩塊預(yù)熱的載玻片上，將載玻片于40℃加熱板上加熱，直到載玻片的沉淀物完全干燥；于預(yù)熱的蓋玻片上滴一滴甘油明膠，使其在蓋玻片對(duì)角形成一個(gè)大的十字，將蓋玻片緩慢地蓋在沉淀物上，以防止形成氣泡。蓋好蓋玻片后稍稍加熱，以保證甘油明膠均勻地分布并使花粉充分膨脹，在甘油明膠冷卻凝固后進(jìn)行顯微鏡觀察分析。

1.3.2 椴樹蜜總酚含量的測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定椴樹蜜中的總酚含量[19-20]。準(zhǔn)確吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（1.0 g/L）0、80、160、240、320、400、480、560 μL 分別置于 2 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混勻后待測(cè)。取各濃度沒食子酸上清液0.5 mL與2.5 mL 0.2 mol/L福林酚溶液混合，5 min后加入100 g/L的碳酸鈉溶液2 mL，加水定容至10 mL，反應(yīng)2 h后（避光），以蒸餾水為空白對(duì)照，在760 nm下測(cè)定吸光度值。以沒食子酸的量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品上清液0.5 mL與2.5 mL的0.2 mol/L福林酚溶液混合，5 min后加入100 g/L的碳酸鈉溶液2 mL，用10 mL容量瓶定容，反應(yīng)2 h后（避光），在760 nm條件下測(cè)定吸光度值。

1.3.3 椴樹蜜DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別取 100 μL 的 10、25、40、55、70 g/L 的蜂蜜樣品水溶液各加100 μL的0.05 g/L DPPH甲醇溶液（避光，現(xiàn)用現(xiàn)配）于96孔板中，室溫（25℃）避光反應(yīng)30 min，在517nm下測(cè)定吸光度記為A2；100μLDPPH甲醇溶液+100 μL蒸餾水與 100 μL甲醇溶液 +100 μL蜂蜜樣品水溶液在上述條件下測(cè)得的吸光度值分別記為A1、A3。計(jì)算各樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。根據(jù)椴樹蜜溶液濃度及清除率，通過GraphPad Prism 5軟件，計(jì)算出IC50值。

1.3.4 椴樹蜜ABTS+自由基清除能力的測(cè)定（ABTS法）

按照試劑盒內(nèi)說明書提供的方法測(cè)定椴樹蜜總抗氧化能力。按說明書方法配制各工作液，在96孔板中每孔依次加入：10μL各濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)液（0、0.015、0.045、0.105、0.21、0.42 mmol/L）或樣品溶液 +20 μL 肌紅蛋白工作液+150 μL ABTS工作液，5 min后各孔加入100 μL反應(yīng)停止液，于405 nm測(cè)定吸光度。

1.3.5 椴樹蜜鐵離子還原能力的測(cè)定[（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）]

按照試劑盒內(nèi)說明書提供的方法測(cè)定椴樹蜜總抗氧化能力。按說明書方法配制各工作液，在96孔板中每孔加入：180 μL FRAP工作液+5 μL蒸餾水或各濃度 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液（0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L）或樣品溶液。37℃孵育5min后于593nm測(cè)定吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

有數(shù)據(jù)經(jīng)excle和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作，試驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 椴樹蜜純度測(cè)定

顯微鏡下觀察花粉形態(tài)，椴樹花粉特征明顯，見圖1。

圖1 椴樹花粉顯微鏡下形態(tài)（×400）Fig.1 The morphology for linden pollen under the microscope（×400）

從圖1中可以看出椴樹花粉外觀呈圓形至橢圓狀態(tài)，圓內(nèi)可見一類三角形圖案，特征明顯，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致。而其余花粉或呈圓形，內(nèi)部布滿小點(diǎn)，或外觀呈三角形，與椴樹蜜花粉區(qū)別明顯。通過對(duì)16批椴樹蜜分別進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果見表2。

由表2可知，發(fā)現(xiàn)所有樣品中均能觀察到椴樹花粉的存在，說明均為椴樹蜜。但所含椴樹花粉占總花粉的量不同，從7.14%～76.73%不等，表明其所含椴樹蜜的純度差異較大。依據(jù)文獻(xiàn)[13]，其中7批次的椴樹蜜中椴樹花粉率大于50%，可判定為椴樹單花蜜，其他批次椴樹花粉率小于50%，判定為椴樹雜花蜜。

2.2 椴樹蜜總酚含量

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果以沒食子酸量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011x+0.023 9（R2=0.999）（圖 2）。

表2 各批次椴樹蜜花粉含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 2 Determination of pollen content of each batch of Linden honey（n=3）

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 The standard curve for gallic acid

椴樹蜜總酚含量以相對(duì)沒食子酸的量表示，詳細(xì)結(jié)果見表3。表3結(jié)果顯示椴樹蜜總酚含量以沒食子酸計(jì)在 174.64 μg/g ～329.18 μg/g，總酚含量最高的為 2 號(hào)椴樹蜜，為329.18 μg/g，其次為8號(hào)椴樹蜜，總酚含量最低為4號(hào)椴樹蜜，為174.64μg/g，其中椴樹單花蜜總酚含量為 174.64 μg/g ～222.82 μg/g，椴樹雜花蜜總酚含量為 223.73 μg/g ～392.18 μg/g。椴樹雜花蜜總酚含量稍低于單花蜜，但不具有顯著差異。

2.3 椴樹蜜對(duì)DPPH自由基的清除作用

16批椴樹蜜對(duì)DPPH自由基均有不同程度的清除作用，且清除率隨樣品濃度的增加而增強(qiáng)。由表3可知，各批次椴樹蜜DPPH自由基清除率IC50值在（24.72±6.89）g/L ～（107.76±34.17）g/L 之間，其中椴樹單花蜜 IC50值為（46.61±10.91）g/L ～（107.76±34.17）g/L，椴樹雜花蜜 IC50值為（24.72±6.89）g/L ～（76.75±8.09）g/L，沒有顯著區(qū)別。與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的椴樹蜜DPPH清除率IC50值35.35 mg/mL～87.93 mg/mL基本吻合。

表3 各批次椴樹蜜抗氧化能力及總酚含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of antioxidant capacity and total phenolic content of all selected samples of Linden honey

2.4 椴樹蜜對(duì)ABTS+自由基的清除能力

標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 The standard curve

以Trolox濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-1.479 7x+1.044 9（R2=0.992 9）（圖 3A）。以 Trolox計(jì)，16批椴樹蜜 ABTS+自由基的清除能力為 （0.14±0.07）mmol/kg ～（0.56±0.04）mmol/kg，其中椴樹單花蜜ABTS+自由基的清除能力為（0.14±0.07）mmol/kg ～（0.43±0.10）mmol/kg，椴樹雜花蜜ABTS+自由基的清除能力為（0.25±0.01）mmol/kg ～（0.56±0.04）mmol/kg，詳細(xì)結(jié)果見表 3。

2.5 椴樹蜜的鐵離子還原能力

以FeSO4濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.311 9x+0.048 4（R2=0.9999）（圖3B）。以FeSO4計(jì)16批椴樹蜜鐵離子還原能力為（1.96±0.08）mmol/kg ～（3.81±0.11）mmol/kg，其中椴樹單花蜜鐵離子還原能力為（1.96±0.08）mmol/kg ～（2.82±0.08）mmol/kg，椴樹雜花蜜鐵離子還原能力為（2.08±0.07）mmol/kg ～（3.81±0.11）mmol/kg，詳細(xì)結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

收集的16批樣品為蜂農(nóng)認(rèn)定的椴樹蜜，均檢測(cè)到椴樹花粉，但花粉測(cè)定結(jié)果顯示椴樹花粉含量差異較大，從7.14%到76.73%不等，因此，可根據(jù)椴樹花粉含量判斷椴樹蜜的純度，以區(qū)分椴樹單花蜜與雜花蜜。結(jié)果表明，其中7批椴樹蜜中椴樹花粉含量大于50%，定義為椴樹單花蜜；9批椴樹花粉含量小于50%，定義為椴樹雜花蜜。本文還對(duì)各批次椴樹蜜的總酚含量進(jìn)行了測(cè)定，總酚含量以沒食子酸計(jì)在174.64 μg/g ～329.18 μg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致，其中椴樹單花蜜總酚含量為 174.64 μg/g ～222.82 μg/g，椴樹雜花蜜總酚含量為223.73 μg/g ～329.18 μg/g，二者差異不大。大量研究表明總酚含量與抗氧化活性存在一定的關(guān)系[21-22]，一般來說總酚含量越高，其抗氧化活性越好。采用DPPH法、ABTS法及FRAP法3種方法對(duì)椴樹蜜的抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，所有批次椴樹蜜均具有一定抗氧化作用，抗氧化活性與其總酚含量呈正相關(guān)，但單花蜜與雜花蜜的抗氧化能力差異不大，表明椴樹蜜抗氧化活性與椴樹蜜純度相關(guān)性不強(qiáng)。