楊 秦

邵陽學(xué)院 湖南 邵陽 422000

背景介紹

肺癌是最常見的診斷癌癥和全球癌癥死亡的最常見原因,占2012年估計有180萬新發(fā)病例和160萬例死亡。大約85%的肺癌被歸類為非小細(xì)胞肺癌。根據(jù)監(jiān)測、流行病學(xué)和癌癥統(tǒng)計綜述，非小細(xì)胞肺癌的5年生存率低至23.6%，因為只有19%的病例在局部分期被診斷，而該疾病是高度可治愈的，5年生存率為59.5%(1)。

miRNAs是內(nèi)源性的18-24個核苷酸的非編碼小rna，在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)中起重要的調(diào)節(jié)作用。這些小rna與細(xì)胞周期、凋亡、增殖、分化、代謝途徑和細(xì)胞對各種應(yīng)激的反應(yīng)有關(guān)。據(jù)估計，miRNAs調(diào)節(jié)30%至60%的人類基因。當(dāng)前癌癥研究面臨的最重要的問題之一是對化療、放療和靶向治療的耐藥性。最近的研究表明，miRNAs可以作為多種癌癥的潛在預(yù)警生物標(biāo)記物。miR-21水平可以從相反的方向改變藥物對細(xì)胞毒性作用的敏感性，這表明存在不同的機(jī)制來決定癌細(xì)胞的毒性。多項研究表明，miRNAs可以控制腫瘤治療的反應(yīng)。在許多類型的癌癥中，人們已經(jīng)研究了miR-21表達(dá)與治療反應(yīng)的相關(guān)性。在乳腺癌中，miR-21過表達(dá)介導(dǎo)耐藥性。在曲妥珠單抗白血病中，miR-21在抗柔紅霉素白血病細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。胃癌中，miR-21過表達(dá)誘導(dǎo)對順鉑(DDP)的耐藥。更在乳腺癌中，miR-21過表達(dá)介導(dǎo)耐藥性。非小細(xì)胞肺癌患者血漿中miR-21過表達(dá)被發(fā)現(xiàn)是吉非替尼反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測因子(2)。

本實(shí)驗通過比對MRC5，順鉑敏感A549以及順鉑耐藥A549細(xì)胞中miR-21的相對表達(dá)，為更深的了解miR-21和非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥提供理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗材料與方法

主要材料：本實(shí)驗所得的細(xì)胞都來自中科院上海細(xì)胞資源庫；培養(yǎng)順鉑敏感A549細(xì)胞和順鉑耐藥A540/DDP細(xì)胞的血清來自于BI公司；細(xì)胞裂解液，RNA inhibitor來自賽末飛公司；引物由上海生工公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，q-PCR所需sybergreen來自EB公司；順鉑藥物來自欣諾。

細(xì)胞培養(yǎng)：MRC5，順鉑敏感A549以及順鉑耐藥A549細(xì)胞均在將普通貼壁細(xì)胞條件下培養(yǎng)(順鉑耐藥A549細(xì)胞的培養(yǎng)需同時添加順鉑藥物)。

反轉(zhuǎn)錄和Q-PCR實(shí)驗：均采用常見方法。

結(jié)果

圖 1.miR-21在三種肺細(xì)胞系中的相對表達(dá)。相對于肺正常細(xì)胞系mrc5，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A549/DDP中的miR-21都出現(xiàn)顯著上升。

細(xì)胞系miR-21相對表達(dá)量第一次實(shí)驗第二次實(shí)驗第三次實(shí)驗平均值p值是否小于0.05與MRC5比與A549比MRC51111A5491.9231.7821.8021.836是A549/DDP2.5222.4862.3902.466是是

討論

關(guān)于原發(fā)腫瘤的miRNA表達(dá)，有報道稱，與miR-21表達(dá)較高的腫瘤患者相比，低表達(dá)miR-21的非小細(xì)胞肺癌患者似乎從輔助鉑基化療中獲益良多。在放療耐藥方面，miR-21上調(diào)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對輻照的敏感性，而miR-21下調(diào)可顯著提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對輻照的敏感性。miR-21過表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡的影響通過激活PI3K/Akt信號通路而增強(qiáng)。必須指出的是，根據(jù)最近的發(fā)現(xiàn)，外泌體似乎也參與了肺癌治療的耐藥性。A549細(xì)胞暴露于DDP會導(dǎo)致細(xì)胞比正常情況下釋放更多的外泌體，而這些外泌體與其他A549細(xì)胞的相互作用會增加A549細(xì)胞對DDP的抗性。當(dāng)暴露于DDP后，A549細(xì)胞受到刺激，外泌體和癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平顯著升高[2]。

基于miRNA的治療可能是一種非常聰明的癌癥靶向治療方法，因為一個負(fù)責(zé)特定功能或機(jī)制的miRNA可以同時靶向幾個下游基因。miR-21過表達(dá)參與肺癌等惡性腫瘤的許多致癌途徑。本次實(shí)驗的結(jié)果同樣說明miR-21在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中起到促進(jìn)順鉑藥物的耐受。開發(fā)一種抑制miR-21的靶向治療似乎很有希望。但也存在一些局限性，如如何在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到足夠的劑量才能有效抑制miRNA，以及miR-21的合適劑量。然而，到目前為止，大部分研究都是在體外進(jìn)行的，仍需要進(jìn)行基于anti-miR-21系統(tǒng)或局部靶向傳遞的體內(nèi)研究。由于miR-21在大多數(shù)人類腫瘤中過表達(dá)，anti-miR-21的治療傳遞可能仍然對大量無法治愈的癌癥有益。然而，毫無疑問，還有大量的工作要做，有必要等待臨床試驗的藥代動力學(xué)結(jié)果，以評估這些分子的安全性和效率。