元青苗 段玉寶*

(1.西南林業(yè)大學，云南省高校極小種群野生動物保育重點實驗室，昆明，650224；2.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，昆明，650224)

隨著分子生物學的發(fā)展，更多的鳥類(Aves)mtDNA基因全序列被測定[1]，線粒體基因組作為一種研究手段在揭示鳥類的起源、系統(tǒng)發(fā)生[2-3]、分歧時間的研究中發(fā)揮著重要作用[4-5]。在mtDNA的13個蛋白編碼基因中，COI和Cytb基因常用于動物類群的分類和系統(tǒng)發(fā)生關系的研究中[6-7]，具有良好的解析作用。

1 材料與方法

1.1 材料數(shù)據(jù)來源

用于研究的樣品采集于云南省西北部的瀘水縣高黎貢山，在此區(qū)域中獲得1只黃腰響蜜個體；取0.5 g左右的肌肉組織，采用無水乙醇進行浸泡，保存于西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院。其余19個物種的COI和Cytb基因序列均來自于NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫。其中，將犀鳥目(Bucerotiformes)作為外群[11]，共下載2條序列。每條COI和Cytb序列的長度分別大于650 bp和861 bp。物種信息詳見表1。

表1 本研究所需的物種基因序列信息Tab.1 List and gene information of species in this study

1.2 DNA的提取、擴增及測序

從采集的肌肉組織樣品中提取總線粒體DNA，DNA提取完成后加入100 μL ddH2O進行溶解，保存于-20℃的冰箱中。

線粒體基因組的引物和反應體系參照Sorenson等[12]的研究。DNA提取和PCR初步擴增完成后，經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察，然后將擴增成功的產物送往上海派森諾生物科技有限公司進行測序。黃腰響蜜的線粒體全基因組信息也已提交NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號為MH737741。

2 數(shù)據(jù)處理

2.1 序列處理

在MEGA 7軟件[13]中導入目標物種的序列，20條序列進行多重比對，比對好后對序列進行剪切，每條COI基因序列的最終長度均為650 bp，Cytb序列為861 bp。然后將比對剪切好的COI和Cytb序列分別整理成Fasta和Mega格式進行保存。

2.2 線粒體COI和Cytb基因的飽和性檢驗

運用DAMBE 5.2.63軟件[14]分析所有物種的序列飽和性。如果Iss與Iss.c滿足Iss

2.3 響蜜科鳥類種間遺傳距離計算

在MEGA7中，選用Kimura 2-parameter模型[15]計算響蜜科響蜜屬4種鳥類的種間遺傳距離。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

使用貝葉斯法(bayesian inference，BI)[16]和最大似然法(maximum likelihood，ML)[16]建樹。在ClustalX 1.83軟件中轉換整理好的序列文件的格式，保留為Nexus和Phylip格式。

構建樹算法可以采用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)算法提供所有樹的驗證頻率。最高的后驗概率樹是最優(yōu)解，也是最優(yōu)選擇的樹[17]。在jModelTest 0.1.1軟件[18]中算出核苷酸替代類型數(shù)(nst)、位點間速率分布(rates)等參數(shù)以及分析出研究系統(tǒng)發(fā)育關系最優(yōu)的模型為GTR+I+G。MrBayes軟件是構建BI樹的常用軟件[19]，該軟件只支持貝葉斯法建樹，所以本文運用MrBayes v3.2.1構建BI樹。建樹時使用4個馬爾可夫鏈，外群則選擇棕犀鳥(Buceroshydrocorax)。運行后，共進行2次run，二者相互獨立，將起始的25%作為burn-in刪除。運行20萬代后，給出的標準誤差(sd)小于0.01，則運算結束。最后，在Figtree v1.2.2中查看生成的文件。

最大似然法建樹則是通過概率的計算進行的，ML系統(tǒng)發(fā)育樹可以利用MEGA7進行構建。

2.5 分歧年代評估

使用BEAST v2.5.2軟件[20-21]估算黃腰響蜜的分歧時間，此方法根據(jù)Jarvis等[11]依據(jù)鳥類化石記錄對多個目的分歧時間估算的結果作為校正點，啄木鳥目和佛法僧目(Coraciiformes)的分化時間約為43 Ma，犀鳥目的分化時間發(fā)生約為58 Ma。將 “*.nxs”格式的文件用于分析，采用松弛的分子鐘(relaxed clock log normal)模型，樹的先驗值計算選擇Yule Model模型，運行1 000萬代。使用Tracer v1.5評估結果的穩(wěn)定性，之后再進一步分析，最終得到一個含有物種分歧時間的樹文件?？稍贔igtree v1.2.2中查看含有黃腰響蜜分化時間的文件。

3 結果與分析

3.1 基因序列飽和性分析

通過DAMBE 5.2.63軟件分析20個物種的核苷酸序列飽和性，導入Fasta格式的序列文件，COI序列分析結果顯示Iss=0.191 3

此外，為了更加直觀地看出核苷酸序列的飽和程度，做飽和度分析的散點圖(圖1A和圖1B)，橫坐標為F84遺傳距離；縱坐標為轉換Ts和顛換Tv數(shù)。圖1A顯示，當F84距離為0.330 8時，Ts與Tv并未相等，未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，則本研究所獲得的COI序列可以構建系統(tǒng)發(fā)育樹。同樣地，當F84距離為0.441 8時，Ts與Tv未相等，未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象(圖1B)，則本研究所獲得的Cytb序列可以構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3.2 響蜜科鳥類種間遺傳距離分析

表2 基于COI基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.2 Genetic distance between species of Indicatoridae based on COI

表2 基于COI基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.2 Genetic distance between species of Indicatoridae based on COI

序號No.種名Species12341鱗喉響蜜Indicator variegatus2斑響蜜Indicator maculatus0.0213小響蜜Indicator exilis0.1120.0934黃腰響蜜Indicator xanthono-tus0.1200.1200.154

表3 基于Cytb基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.3 Genetic distance between species of Indicatoridae based on Cytb

表3 基于Cytb基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.3 Genetic distance between species of Indicatoridae based on Cytb

序號No.種名Species12341鱗喉響蜜Indicator variegatus2斑響蜜Indicator maculatus0.0323小響蜜Indicator exilis0.1320.1264黃腰響蜜Indicator xanthono-tus0.1770.1780.194

3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用COI(圖2A)和Cytb(圖2B)基因重建的BI和ML系統(tǒng)發(fā)育樹結構顯示出兩種基因構建的系統(tǒng)樹拓撲結構基本一致，具有相似的系統(tǒng)發(fā)育關系，以BI樹的拓撲結構作為展示。據(jù)圖顯示，黃腰響蜜與響蜜科響蜜屬聚為一大支(A：PP=0.99，BP=82；B：PP=1.00，BP=100)，與啄木鳥科互為姐妹群，并有較高的支持率(A：PP=0.97，BP=75；B：PP=0.96，BP=74)。在響蜜科內部，黃腰響蜜構成單系；在4種鳥類中，最早分化出來的類群是黃腰響蜜，其次是小響蜜(Indicatorexilis)。鱗喉響蜜(Indicatorvariegatus)與斑響蜜(Indicatormaculatus)聚為一支(A：PP=0.98，BP=91；B：PP=1.00，BP=100)。

3.4 分歧時間分析

Tracer v1.5軟件中顯示Ess值大于200，說明在BEAUti中設置的參數(shù)是合理的，最后得到含有物種分歧時間的樹文件。響蜜科鳥類的分化時間詳見圖3，可知響蜜科鳥類起源于新第三紀中新世時期，距今約20.44(15.88，25.77)Ma，而黃腰響蜜也在此時間段內分化出來(20.44 Ma)。此外，在漸新世和中新世階段，啄木鳥目鳥類的多樣性不斷擴大，物種多樣性越來越豐富。

4 討論

4.1 黃腰響蜜的系統(tǒng)發(fā)育分析

COI和Cytb基因片段序列被廣泛地應用于解決鳥類的分子系統(tǒng)發(fā)育問題[22]。本文的結果顯示，黃腰響蜜聚在響蜜科響蜜屬物種所在分支里，并且有著很高的支持率。黃腰響蜜所在的響蜜科與啄木鳥科有著姐妹群的關系，這與Prum等[23]的研究結果一致。而在響蜜科內部，黃腰響蜜是最早分化出來的物種，其次是小響蜜；且黃腰響蜜無姐妹群。

4.2 黃腰響蜜的起源分化

本研究分子定時的結果顯示啄木鳥科分化于14.95(14.02，15.89)Ma，與Prum等[23]的研究結果(Prum等研究表明啄木鳥科的分化時間約為15 Ma)相近，表明了分歧時間推斷的合理性和準確性，進而為評估黃腰響蜜的分歧時間提供支持。響蜜科鳥類的分化可追溯到新生代新第三紀中，黃腰響蜜在新第三紀中新世階段分化，時間節(jié)點為20.44(15.88，25.77)Ma。在這一時期，青藏高原發(fā)生了廣泛的隆起(22—20 Ma)，并隨著多個隆升事件[24-25]，直到3.4 Ma到1.6 Ma，高原抬升4 000 m以上，這被認為顯著影響了其形貌和鳥類物種的多樣化[26]。所以黃腰響蜜的形成可能與青藏高原隆起有關，其歷史和地理模式受到了青藏高原及周邊區(qū)域隆升的強烈影響。