董 路 何紫薇 程文杰 楊建發(fā) 代飛燕 鄒豐才 楊林富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)屬于球蟲亞綱，弓形體屬，是一種地域分布廣泛且宿主眾多的重要人獸共患寄生蟲，是能夠感染所有溫血和少數(shù)冷血動物的胞內(nèi)寄生性原蟲[1]。鳥類(Aves)及幾乎所有的哺乳動物(Mammalia)，甚至一些水生動物都有可能成為弓形蟲的中間宿主[2]。弓形蟲也極易感染人(Homosapiens)，據(jù)調(diào)查顯示全球約有30%的人感染弓形蟲，我國人群平均陽性率為7.88%[3]。人可通過食入被弓形蟲卵囊或包囊污染的食物和水源感染弓形蟲[4]，或是長期與寵物糞便接觸或清潔不當也會導(dǎo)致感染。弓形蟲病的危害極大，可造成孕婦早產(chǎn)、流產(chǎn)和胎兒發(fā)育畸形等，也是免疫缺陷癥患者的主要死亡原因之一。同時該病對鳥類的感染會增加周圍人群感染弓形蟲的風(fēng)險，尤其會給禽類養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失，并且對生態(tài)環(huán)境也會造成潛在的危害。

紅嘴鷗(Chroicocephalusridibundus)是中國內(nèi)陸及沿海地區(qū)最常見的中型候鳥之一，屬于鸻形目(Charadriiformes)鷗科(Laridae)鷗屬，因其嘴和腳皆呈紅色，故稱為紅嘴鷗[5-6]。紅嘴鷗屬“三有”保護動物。紅嘴鷗每年10月下旬，分別從新疆博斯騰湖、俄羅斯西伯利亞地區(qū)的貝加爾湖、蒙古國烏布蘇湖區(qū)域3條路線遷移至云南，次年3月再飛回北方[7]。遷徙至云南過冬的紅嘴鷗主要食取魚蝦(占進食量的95%)，昆蟲(4%)，植物性食物(1%)[8]。其在昆明比較集中的幾個棲息地即滇池、翠湖公園[9]、環(huán)西橋，玉溪撫仙湖等，其棲息環(huán)境正好是老鼠、流浪貓等動物的出沒頻繁之地，并且在滇池周邊村落還存在有散養(yǎng)雞飼養(yǎng)的情況，這幾種動物都是弓形蟲傳播的重要中間或終末宿主，這勢必為紅嘴鷗感染弓形蟲提供了條件。目前，關(guān)于滇池紅嘴鷗感染弓形蟲的相關(guān)報道仍較少。為了解遷入云南滇池越冬的紅嘴鷗弓形蟲感染情況，本調(diào)查選取滇池紅嘴鷗為主要研究對象，并對周邊紅嘴鷗棲息環(huán)境中的褐家鼠(Rattusnorvegicus)、散養(yǎng)土雞(Gallusgallusdomestiaus)等動物的弓形蟲感染情況進行調(diào)查研究。明確紅嘴鷗弓形蟲的感染時間和感染源，為遷徙候鳥弓形蟲病溯源、預(yù)防、診療等提供參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于2017—2019年，從昆明滇池共采集到紅嘴鷗血液樣品403份，分離得到血清386份。此外，分別從玉溪市江川縣江城鎮(zhèn)、昆明市?？阪?zhèn)和晉寧區(qū)晉城鎮(zhèn)、昆陽鎮(zhèn)采集周邊環(huán)境動物樣品162只，其中褐家鼠128只，散養(yǎng)土雞34只，解剖取其心、肝、肺、腎、腦、肌肉等組織樣品放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

弓形蟲間接血凝實驗(IHA)試劑(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)、基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、dNTPs(購自大連寶生物工程有限公司)、2×TaqPCR Master Mix、rTaqDNA聚合酶等。

1.2 方法

1.2.1 間接血凝實驗(IHA)檢測紅嘴鷗弓形蟲抗體

在一次性96孔110°V型塑料反應(yīng)板上進行弓形蟲抗體檢測，加樣前在反應(yīng)板上做好樣品編號的標記，實驗操作和結(jié)果判定標準嚴格按照檢測說明書進行。

1.2.2 弓形蟲鏡檢觀察

將采回的褐家鼠、農(nóng)戶散養(yǎng)土雞樣本進行解剖后，分別挑取腦組織充分研磨，加入少量生理鹽水。吸取約20 μL腦組織懸液滴涂在載玻片上，鏡檢觀察是否存在弓形蟲病原體。

1.2.3 巢式PCR檢測弓形蟲病原

1.2.3.1 全基因組DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書提取各動物全基因組DNA。并將提取的DNA 保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 巢式PCR擴增弓形蟲B1基因

擴增引物參照Alfonso等[10]所報道的B1基因引物序列，并優(yōu)化其擴增體系和條件，預(yù)期擴增目的片段大小為530 bp，引物序列如下：

(1)外引物

B1-F1：5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′

B1-R1：5′-ACGGATGCAGTTCCTTTCTG-3′

(2)內(nèi)引物

B1-F2：5′-TCTTCCCAGACGTGGATTTC-3′

B1-R2：5′-CTCGACAATACGCTGCTTGA-3′

1.2.3.2.1 巢式PCR擴增體系及條件

在200 μL滅菌PCR管中依次加入滅菌ddH2O(第一輪、第二輪分別為9.5 μL、10.5 μL)、上游引物、下游引物各0.5 μL、2×TaqPCR Master Mix12.5 μL和模板DNA(第一輪、第二輪分別為2 μL、1 μL)，混勻后瞬時離心，PCR擴增反應(yīng)總體系為25 μL。設(shè)立弓形蟲RH株DNA為陽性對照模板，ddH2O為陰性對照模板。兩輪PCR擴增程序參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán)，94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)，最后72℃終延伸7 min。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，取凝膠塊置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.3.2.2 PCR產(chǎn)物測序及序列的比對分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子大小，選取條帶大小為530 bp左右的PCR產(chǎn)物送至生工進行測序。采用NCBI上的BLAST工具與數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅嘴鷗IHA檢測結(jié)果

采用IHA弓形蟲血清抗體檢測試劑盒，共檢測滇池紅嘴鷗血清樣本386份。其中有44份血清檢測為弓形蟲抗體陽性，最高抗體效價為1∶512，總陽性率為11.40%。按遷徙時間分析，遷入3個月后(3月)陽性率略高于遷入時，為11.94%；按年齡分析，成年鷗陽性率最低，為10.73%，亞成鷗陽性率最高，為55.56%，幼鷗次之；按體重分析，體重小于250 g陽性率最低，為3.13%，體重在250—300 g的陽性率為最高，為10.94%，大于300 g的陽性率次之，為13.58%(表1)。

表1 滇池紅嘴鷗弓形蟲血清抗體檢測總結(jié)果Tab.1 Serum antibody test results of Toxoplasma gondii infection in black-headed gulls in Dianchi Lake

續(xù)表1

2.2 弓形蟲鏡檢觀察結(jié)果

分別取出褐家鼠、散養(yǎng)土雞完整腦組織研磨后作涂片，在顯微鏡下觀察。在1只昆陽褐家鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)圓形包囊結(jié)構(gòu)(圖1)。后經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為弓形蟲包囊，包囊內(nèi)可以觀察到許多個密集的滋養(yǎng)體(緩殖子)。

2.3 巢式PCR檢測結(jié)果

2.3.1 弓形蟲B1基因檢測結(jié)果

本實驗PCR產(chǎn)物均擴增出大小約530 bp的目的片段，與預(yù)期目的條帶相符，且陰、陽性對照正常。經(jīng)上海生工測序，測序結(jié)果顯示所擴增的目的DNA片段確定為弓形蟲序列。B1基因巢式PCR產(chǎn)物電泳圖見圖2。

2.3.2 紅嘴鷗弓形蟲感染情況

檢測結(jié)果顯示，紅嘴鷗弓形蟲感染率為3.23%，棲息環(huán)境中動物所有動物弓形蟲平均感染率為9.03%，其中褐家鼠感染率為17.19%，散養(yǎng)土雞為47.06%。有13只紅嘴鷗血液樣品檢測為陽性，紅嘴鷗棲息環(huán)境中，晉寧晉城鎮(zhèn)10只散養(yǎng)土雞弓形蟲感染率達100%，而江川江城鎮(zhèn)散養(yǎng)土雞感染率為0；晉寧兩鎮(zhèn)共22只褐家鼠檢測為弓形蟲陽性。陽性組織中心肝、肌肉組織檢出率最高(表2)。

表2 紅嘴鷗和棲息環(huán)境部分動物弓形蟲感染情況匯總Tab.2 Test results of PCR based on Toxoplasma gondii B1 gene in black-headed gulls and some of the animals in habitat environment

3 討論

3.1 紅嘴鷗弓形蟲流行情況分析

滇池流域由北向南共分布12個濕地，每年冬季都吸引了多種候鳥遷徙至此。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，滇池周邊濕地共聚集鳥類182種，主要由游禽、鳴禽和涉禽組成，其中紅嘴鷗數(shù)量最多(54.77%)，并圍繞整個滇池周邊濕地分布棲息[11]。Miao等[12]曾在2012—2013年，通過對滇池的659只紅嘴鷗調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，其中131只紅嘴鷗血清中檢測出弓形蟲抗體，陽性率為19.9%。李朝等[13]在2017—2018年，對186份紅嘴鷗血清樣本進行弓形蟲抗體檢測，結(jié)果顯示，弓形蟲抗體陽性率為11.29%，且年齡為主要感染風(fēng)險因素。本調(diào)查結(jié)果顯示，滇池紅嘴鷗平均血清陽性率為11.40%，與Miao等[12](2013年)報道的結(jié)果相比有所降低，分析可能有以下原因：由于紅嘴鷗遷徙群體龐大，數(shù)量逐年增長，該調(diào)查采集的紅嘴鷗對象中未發(fā)現(xiàn)有佩戴腳環(huán)的紅嘴鷗，由此說明，與4年前采集的紅嘴鷗是同一批次的可能性極小。另一方面，可能由于氣候環(huán)境變化的影響以及紅嘴鷗有充足食物來源，使其自身免疫力提升，不易被感染。

3.2 紅嘴鷗棲息地動物弓形蟲流行情況分析

貓(Felis)、鼠(Rattus)是弓形蟲重要宿主，其在弓形蟲病的傳播中起到關(guān)鍵作用。20世紀70年代，研究者們通過抗體血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)世界各地區(qū)無論是家貓還是流浪貓以及野生貓科(Felidae)動物都有潛在弓形蟲感染現(xiàn)象[14-15]。農(nóng)村貓的弓形蟲感染率為44.89%，城市貓的感染率19.64%[16]。Zhang和Yan等[17-18]在2014年研究發(fā)現(xiàn)，中國北部和東北部地區(qū)野老鼠弓形蟲感染率分別達到53.8%和23.6%。此外，雞是弓形蟲重要中間宿主之一，2010年Zhao等[19]對我國13個省共計1 173份雞血清樣品進行弓形蟲循環(huán)抗原(TCA)和抗體(TCAb)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13個省的雞總血清陽性率為30.36%。本調(diào)查基于弓形蟲B1基因，對紅嘴鷗棲息地中褐家鼠和散養(yǎng)土雞感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，褐家鼠、散養(yǎng)土雞的感染率分別為17.19%、47.06%。紅嘴鷗感染率與弓形蟲宿主密切聯(lián)系。貓作為弓形蟲重要宿主，通過糞便排出孢子化卵囊，鼠作為中間攜帶者可被感染，雞、紅嘴鷗等禽類可通過地面覓食，攝入被貓糞便中弓形蟲卵囊污染的食物和水，從而增加了紅嘴鷗感染弓形蟲的幾率。

3.3 紅嘴鷗弓形蟲感染風(fēng)險分析

自1985年紅嘴鷗首次大規(guī)模進入昆明主城區(qū)以后，每年都會有越來越多的紅嘴鷗如期抵達昆明越冬。紅嘴鷗屬于群體遷徙野生候鳥，主要感染時間發(fā)生在遷徙中和遷入后。年齡是主要感染風(fēng)險內(nèi)因素，亞成鳥的血清抗體陽性率顯著高于幼鳥和成鳥，原因可能是其處于生長發(fā)育的中間階段，對于食物的需求量大，通過食物感染弓形蟲的風(fēng)險極大提高。此外，亞成鳥的機體體征處于變化較快的階段，長途遷徙過程中易受外界環(huán)境因素的影響。

環(huán)境條件也是紅嘴鷗感染的一個重要外因素。紅嘴鷗主要集中在滇池周邊公園、垃圾場和村寨等地覓食。而這些地方也是老鼠、貓出沒之地，靠近滇池周邊的村落還存在飼養(yǎng)散養(yǎng)雞的情況；該地區(qū)的水環(huán)境可能被貓糞便中的弓形蟲卵囊污染，因此大大增加了紅嘴鷗弓形蟲感染的風(fēng)險。此外，被弓形蟲卵囊污染土壤也是紅嘴鷗感染弓形蟲的一個重要途徑。據(jù)調(diào)查顯示，昆明地區(qū)貓的糞便弓形蟲卵囊檢出率為4%[20]，Lélu等[21]研究表明，土壤中弓形蟲卵囊對于環(huán)境耐受性較高。翟凱等、杜芬等[22-24]研究發(fā)現(xiàn)公園、居民區(qū)等公共場所，奶牛場、豬場等養(yǎng)殖場地的土壤中均存在弓形蟲卵囊污染。其次，遷徙途中在濕地、淺灘等捕食水中已感染弓形蟲的小型蝸牛、魚蝦等也存在一定感染風(fēng)險。弓形蟲的卵囊在水中至少可以存活6個月[25]，一些魚、貝類可作為弓形蟲傳播的載體從而濃縮水中弓形蟲卵囊。楊振[26]對中國部分地區(qū)水生生物弓形蟲檢測發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)中有弓形蟲感染，陽性率0.65%，由此表明，水生生物在寄生蟲的轉(zhuǎn)寄作用上起到了關(guān)鍵作用。