曾 敏 周 宇 明 珠 成彥曦 晉 蕾 王 靜黃 炎 李德生 張和民 吳虹林 鄧雯文 李才武* 鄒立扣*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都，611130；2.四川水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，成都，611230；3.大熊貓國家公園珍稀動物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室中國大熊貓保護(hù)研究中心，成都，611830)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是舉世矚目的珍稀易危動物，被譽(yù)為中國的國寶，越來越受到國內(nèi)外各界人士的喜愛和重視。大熊貓健康和營養(yǎng)狀況等成為學(xué)者關(guān)注的對象，早期研究中由于大熊貓血液樣本數(shù)量較少，且測定方法等不同，導(dǎo)致研究結(jié)果差異較大、測定結(jié)果無法對比使用[1]。王強(qiáng)等[2]對18只大熊貓，董全等[3]對12只大熊貓分別進(jìn)行了26項和32項血液生理生化指標(biāo)測定，但數(shù)據(jù)量難以適用于現(xiàn)階段大熊貓臨床診療和健康管理等。大熊貓血液中微量元素含量能在一定水平上反映出大熊貓的飼養(yǎng)方式、飼料中微量元素含量及其體內(nèi)相應(yīng)元素的營養(yǎng)狀況[4]，血液對于維持動物機(jī)體的正常生命活動具有極其重要的意義，血液指標(biāo)能客觀地反映動物機(jī)體的生理機(jī)能與代謝狀況[5]。本研究通過較大樣本數(shù)量采集大熊貓血液樣本，測定大熊貓血液微量元素、血常規(guī)及生理生化指標(biāo)，以期通過對大熊貓數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，為大熊貓相關(guān)指標(biāo)列出參考值，從而為大熊貓疾病診斷和科學(xué)研究提供依據(jù)。

1 研究方法

選擇飼養(yǎng)于中國大熊貓保護(hù)研究中心的 73只圈養(yǎng)大熊貓，其食物由竹子(竹子包括竹竿和竹葉)、竹筍、精飼料(主要由黃豆、大米、玉米粉混合蒸煮而成)、蘋果、胡蘿卜和微量元素營養(yǎng)添加劑等按照比例搭配構(gòu)成。73只大熊貓的年齡及性別情況見表1。

表1 大熊貓基本情況Tab.1 Basic information of giant panda

1.1 樣本采集和制備

在非麻醉狀態(tài)下，通過愛心飼養(yǎng)并進(jìn)行醫(yī)療培訓(xùn)的方式，使大熊貓自愿伸出左前肢或右前肢，以減少大熊貓的損傷和應(yīng)激反應(yīng)，剔除其前臂皮毛暴露出靜脈血管，用一次性靜脈采血針和真空采血管進(jìn)行血液采集工作。采集過程符合大熊貓福利與管理，并未給大熊貓身心健康帶來任何負(fù)面影響。共獲得73只健康圈養(yǎng)大熊貓血液樣本。

1.2 測定方法

1.2.1 血液微量元素檢測

儀器采用國康GK-4全自動微量元素分析儀，使用原裝配套試劑和質(zhì)控品，測定主要5項微量元素指標(biāo)。

1.2.2 血液生理生化檢測

儀器為羅氏公司COBAS C501全自動化分析儀。試劑和校準(zhǔn)品均采用羅氏公司原裝配套試劑，測定主要15項血液生理生化指標(biāo)。

1.2.3 血常規(guī)參數(shù)檢測

采用邁瑞B(yǎng)C5390全自動血液分析儀及原裝配套試劑自動檢測分析，測定18項主要血常規(guī)指標(biāo)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 研究結(jié)果

2.1 大熊貓血液中微量元素含量

由圖1可以看出大熊貓血液中鋅元素等含量較高，為34.3—220.7 μmol/L，其次銅、鐵含量為5.6—24.7 μmol/L，鈣、鎂為1.31—2.17 mmol/L。

進(jìn)一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)大熊貓雌性和雄性組間參數(shù)差異不顯著，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同性別大熊貓血液中微量元素含量Tab.2 Contents of trace elements in blood of giant pandas of different gender groups

按年齡分組分析發(fā)現(xiàn)，年齡分組中鎂元素的含量呈現(xiàn)出亞成年組顯著高于成年組和老年組(P<0.05，*標(biāo)注)。其他微量元素含量未呈現(xiàn)年齡間的顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同年齡組大熊貓血液中微量元素含量Tab.3 Contents of trace elements in blood of giant pandas in different age groups

表4 不同性別、不同年齡間大熊貓血液微量元素含量對比Tab.4 Comparison of trace elements in blood of giant panda between different gender and age

2.2 大熊貓血液生理生化指標(biāo)

由圖2A可以看出，總蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)4項中，ALP范圍較高，為66.5—368.7 g/L，TP次之，為53.5—78.2 g/L，其余兩項范圍為18.0—43.0 g/L。總膽紅素(T-BIL)、直接膽紅素(D-BIL)、間接膽紅素(I-BIL)、血清總膽汁酸(TBA)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)、尿酸(UA)7項中，CREA范圍較高，在73.0—201.0 μmol/L，TBA次之，為35.1—144.8 μmol/L，UA為29.0—96.0 μmol/L，其余4項范圍為0.00—15.14 μmol/L。

使用Kolmogorov-Smirnov檢驗正態(tài)分布后用單因素方法分析，大熊貓性別間各生化指標(biāo)均未呈現(xiàn)性別間顯著差異(P>0.05)(表5)。

表5 不同性別大熊貓血液生理生化指標(biāo)含量Tab.5 Contents of blood physiological and biochemical indexes of giant pandas of different gender groups

表6 不同年齡組大熊貓血液生理生化指標(biāo)含量Tab.6 Contents of blood physiological and biochemical indexes of giant pandas in different age groups

表7 不同性別、年齡間大熊貓血液生理生化指標(biāo)含量Tab.7 Contents of blood physiological and biochemical indexes of giant pandas of different gender and age

2.3 大熊貓血液血常規(guī)指標(biāo)

從圖3A—C中可以看出，圖A中紅細(xì)胞數(shù)(RBC)的范圍為3.74—7.50(1012/L)；中性粒細(xì)胞百分率(NEUT%)較高，為21.00%—82.60%，淋巴細(xì)胞百分率(LY%)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞寬度-CV值(RDWR)、血小板壓積(PCT)、大血小板比率(P-LCR)為1.90%—69.40%。圖B中，血小板數(shù)(PLT)范圍較高，為138.00—622.00(109/L)；平均血紅蛋白濃度(MCHC)的范圍為320.00—360.00。圖C中平均紅細(xì)胞體積(MCV)整體范圍較高，為51.00—76.80，平均血紅蛋白含量(MCH)為17.30—24.90 pg。

性別間各項參數(shù)經(jīng)過檢驗發(fā)現(xiàn)，PDW參數(shù)指標(biāo)性別間差異顯著(P<0.05，*標(biāo)注)，雌性組均值明顯高于雄性組，其余各項參數(shù)指標(biāo)在性別間差異不顯著，具體參數(shù)見表8。

表8 不同性別大熊貓血液血常規(guī)指標(biāo)含量Tab.9 Blood routine index contents of giant pandas of different sex

用one-way ANOVA單因素方差分析(P<0.05，*標(biāo)注)，比較年齡間差異。其中PLT均值隨年齡增大呈明顯下降趨勢，其他參數(shù)指標(biāo)在年齡間明顯差異，數(shù)據(jù)見表9。

表9 不同年齡大熊貓血液血常規(guī)指標(biāo)含量Tab.9 Blood routine index of giant pandas of different ages

表10 不同性別、不同年齡大熊貓血液血常規(guī)指標(biāo)含量Tab.10 Blood routine index contents of giant pandas of different gender and age

3 討論

大熊貓屬于食肉目(Carnivora)、熊科(Ursidae)、大熊貓亞科、大熊貓屬哺乳動物。小熊貓(Ailurusfulgens)也叫紅熊貓，曾被歸入熊科、浣熊科(Procyonidae)、獨立一科，以及與大熊貓同屬一科，現(xiàn)歸為小熊貓科(Ailuridae)。與大熊貓的相似性主要體現(xiàn)在食性的近似。徐素慧等[6]對小熊貓血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定，將本實驗結(jié)果中大熊貓血液生理生化指標(biāo)和血常規(guī)與之對比發(fā)現(xiàn)，WBC、RBC、HGB、TP等參數(shù)指標(biāo)小于小熊貓的范圍，而MCV、UA、ALT、ALP等參數(shù)指標(biāo)則明顯高于小熊貓的范圍。

大熊貓血液中微量元素含量雖然極微，但對大熊貓的健康監(jiān)測與評估、疾病診斷和治療均有非常重要的價值和意義。隨著對微量元素和免疫的深入研究，發(fā)現(xiàn)有不少微量元素影響人或動物免疫系統(tǒng)[7]，微量元素也是反映機(jī)體新陳代謝及生理功能的重要指標(biāo)[8]。例如鐵元素參與機(jī)體氧的運輸和貯存[9]，血清鐵被認(rèn)為是動物營養(yǎng)評估的生化指標(biāo)[10]；缺鐵或多量攝入鐵元素，將影響機(jī)體的生理功能。在飼料中添加適量的微量元素是由于現(xiàn)在大熊貓喂養(yǎng)營養(yǎng)搭配精細(xì)化，為亞成年組熊貓膳食中添加適量補(bǔ)充鐵元素的食物，可促進(jìn)其生長發(fā)育。鋅是動物機(jī)體必需的微量元素，現(xiàn)已證明鋅參與動物體內(nèi)300多種酶和功能蛋白的組成[11]。鎂是動物生活必需元素之一，它對神經(jīng)沖動傳遞和神經(jīng)肌肉應(yīng)激性維持有重要作用，也是體內(nèi)多種酶活動不可缺少的離子[12]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過年齡和性別分組兩兩比較，鎂、鋅、鐵元素在多組兩兩比較中均有差異；按大熊貓年齡分組中鎂元素組間差異顯著，鎂元素在年齡間的差異呈現(xiàn)出老年組<成年組<亞成年組的趨勢。鎂在生物體的生理活動方面起著十分重要的作用，它是機(jī)體能量流通貨幣ATP的重要助手，與ATP一起參加機(jī)體能量代謝過程[13]。徐海等[14]研究表明，高鎂溶液能減輕缺血心肌線粒體的損傷程度，起到保護(hù)缺血心肌的作用。在性別和年齡多重比較中，發(fā)現(xiàn)鎂元素含量均值在雌性組亞成年和成年、亞成年和老年的比較中差異顯著，表現(xiàn)為亞成年組高于成年組和老年組，與僅進(jìn)行年齡分組比較結(jié)果較一致，由此可推斷，大熊貓在亞成年階段鎂元素含量或較高。鋅在性別和年齡多重比較中呈現(xiàn)出亞成年組和成年組差異較顯著，亞成年組鋅均值含量高于成年組。在年齡組比較中，鋅大致也呈現(xiàn)出亞成年組>成年組>老年組的趨勢。鋅在動物體內(nèi)與血漿清蛋白結(jié)合，由血液運輸?shù)礁鹘M織器官，通過參與動物體內(nèi)的酶、脂肪和能量代謝影響機(jī)體[15]。鐵元素則在性別、年齡多重比較中，呈現(xiàn)出均值含量成年組>老年組>亞成年組的趨勢。鐵元素對紅細(xì)胞免疫功能也有影響，鐵供給不足可以影響紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白合成，出現(xiàn)小紅細(xì)胞、低色素紅細(xì)胞貧血，進(jìn)而在一定范圍內(nèi)影響紅細(xì)胞免疫功能[16]。因此，通過食物補(bǔ)充添加適量的鐵元素被認(rèn)為對大熊貓的免疫功能是有幫助的。

血液生理生化值能在一定程度上反映動物新陳代謝及生理機(jī)能狀況[2]。血液學(xué)和血液化學(xué)生理指標(biāo)對大熊貓疾病診斷與治療具有重要價值[17]。檢測結(jié)果顯示ALP、ALT、TP 3項指標(biāo)在大熊貓年齡、性別多組兩兩比較中均有差異；性別間比較差異均不顯著；按年齡分組則ALT、ALP兩項參數(shù)年齡間差異顯著，ALT老年組均值含量相對較低，在反映急性肝細(xì)胞損傷時以ALT最為敏感[18]，ALP亞成組指標(biāo)均值明顯較高，ALP可作為膽汁淤積酶在臨床應(yīng)用[19]。在多重比較中，TP均值含量在雌性組中表現(xiàn)為亞成年組低于成年組和老年組，董全等[3]認(rèn)為大熊貓在血紅蛋白、白細(xì)胞數(shù)量、血清鈉、總蛋白、球蛋白和血糖這6項上同小熊貓更為接近，其余生化指標(biāo)未呈現(xiàn)年齡間顯著差異。造成這些差異的原因有待進(jìn)一步研究，血液生理指標(biāo)的測定不僅受動物年齡、性別、生理狀態(tài)、生活環(huán)境、營養(yǎng)水平的影響，還受測定方法以及動物采食，應(yīng)激等各種因素的影響[20]。

血常規(guī)實驗中按大熊貓性別、年齡多組兩兩對比發(fā)現(xiàn)MCV、NEUT%、LYMPH#、MCH、PLT、P-LCR指標(biāo)有差異；按性別分組發(fā)現(xiàn)，PDW均值含量性別間差異顯著，雄性組明顯低于雌性組，其余各項參數(shù)指標(biāo)在性別間差異不顯著。按年齡分組，PLT均值含量在年齡間差異顯著，呈現(xiàn)出亞成年組>成年組>老年組的趨勢。實驗結(jié)果中，RBC、HGB、MCH、HCT、LR、MR、GR、MCV等項與李才武等[1]研究結(jié)果相近，WBC、MPV結(jié)果與有關(guān)研究結(jié)果差異較大。本研究中WBC隨年齡增大而參考范圍增高，WBC升高是判斷細(xì)菌感染的常用指標(biāo)[21]，其變化也可進(jìn)行腎損害出現(xiàn)時間和損害程度的預(yù)測[22]。MPV在年齡間呈隨年齡增大而參考范圍降低，MPV是評估血小板活性功能的主要指標(biāo)之一[23]，也是慢性乙肝肝硬化的潛在生物標(biāo)志物[24]。有關(guān)于WBC、MPV在指示大熊貓隨年齡增大而患的慢性疾病中的作用可進(jìn)一步研究。

本研究通過對大熊貓采血，收集到的血液樣本進(jìn)行血液微量元素、生理生化指標(biāo)和血常規(guī)的測定，總結(jié)出性別和各年齡段間大熊貓血液生理指標(biāo)參考范圍，以便更精確反映不同性別、不同年齡階段大熊貓的正常參考范圍，可為大熊貓健康狀況判定、臨床診療等提供有價值的參考，為大熊貓保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。