高笑笑，項智灝，陳福增，張 鷺，劉 軍

(復旦大學 生命科學學院，遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

結核病(Tuberculosis)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的傳染性疾病，是世界人口十大死亡原因之一.在將近1/4感染結核分枝桿菌的人群中，我國感染人數占世界感染人口總數的8.4%，位居世界第三，僅次于印度與印度尼西亞[1].缺乏有效的預防性疫苗、快速的診斷方法和耐藥菌株以及結核/HIV共感染的持續(xù)出現(xiàn)是目前結核病控制中存在的主要問題.當前國際上唯一批準使用的用于預防結核病的疫苗仍然是卡介苗(Bacillus-Calmette-Guerin，BCG)，它主要誘導CD4+T細胞分泌Th1型細胞因子，能有效預防嬰兒時期的結核性腦膜炎和播散性結核(約80%保護率)，但對肺結核的保護效果有限，且其保護效果隨時間推移逐漸減弱甚至消失，在成年人群中呈現(xiàn)較大波動(0～80%保護率)[2-4].造成BCG保護效果不足的可能原因之一是BCG基因組中RD1基因片段的缺失.RD1是致病性分枝桿菌基因組中一個9.5kb的片段，包含分枝桿菌ESX-Ⅰ分泌系統(tǒng)的組成基因，BCG中RD1的缺失導致其無法合成ESX-Ⅰ分泌系統(tǒng)抗原Esat-6(也稱EsxA)和Cfp-10(也稱EsxB)，這些重要抗原的丟失可能導致BCG無法提供長期有效的抗結核免疫保護[5].因此，利用結核分枝桿菌中的特異性抗原如Esat-6和Cfp-10等構建亞單位疫苗來加強BCG免疫功能是新型抗結核疫苗研究中的一個重要思路.

亞單位疫苗的形式包括蛋白、DNA或病毒載體疫苗，在結核病的預防和治療兩個層面發(fā)揮作用；自上世紀90年代起始，亞單位疫苗的研究取得了較大進展，現(xiàn)已經有多株候選疫苗在臨床初期取得了較好的試驗結果，其中包括含有Esat-6抗原的H1和H56[6-7]，但迄今還未有通過臨床Ⅲ期評估的疫苗.如何評估候選抗原的有效性，是亞單位疫苗研究中面臨的一個關鍵問題.IFN-γ是宿主防御結核分枝桿菌感染的重要細胞因子[8-9]，抗原特異性CD4+T細胞一直被認為是IFN-γ的主要產生者.因此，能否刺激抗原特異性CD4+T細胞IFN-γ的分泌水平上升是篩選、評估結核病候選疫苗的重要思路，據此發(fā)現(xiàn)的抗原包括Ag85、Esat-6、PPE18等.但是病毒載體疫苗MVA85A在臨床Ⅱb試驗中的失敗提示我們需要對現(xiàn)有的抗原篩選策略進行反思，避免過于單一的篩選標準[10].

在結核分枝桿菌中總共存在5套ESX分泌系統(tǒng)：ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ，分別與分枝桿菌的生長和毒力相關[11-12].結核分枝桿菌感染宿主細胞后，主要存在于宿主吞噬體中，并通過抑制吞噬溶酶體成熟維持其在吞噬體中的生存[13].通過ESX-1依賴的破膜作用，結核分枝桿菌也可以將抗原釋放進入胞質溶膠，細菌本身可能隨后進入細胞質[13].ESX-1系統(tǒng)在細菌中負責原型ESX蛋白的分泌，即6kDa早期分泌抗原靶標(Esat-6)和10kDa培養(yǎng)濾液蛋白(Cfp-10).這兩種蛋白質形成1∶1異源二聚體復合物，是參與宿主-病原體相互作用的結核分枝桿菌最重要的蛋白質之一[12].它們能夠誘導強烈的T細胞介導的免疫反應，是代表致病性結核分枝桿菌的關鍵毒力因子.結核分枝桿菌ESX-Ⅱ～ESX-Ⅴ分泌系統(tǒng)分泌的主要蛋白都屬于Esat-6和Cfp-10家族，在分泌時彼此依賴，并且通過特定的途徑分泌至胞外，協(xié)同影響細菌生理.

迄今為止，已經有多個臨床試驗證實了Esat-6作為疫苗組成抗原的有效性[6-7,14]，如過表達Esat-6的重組BCG能夠比親本BCG誘導更強的IFN-γ應答.但單一抗原有限的表位數量限制了細胞或體液免疫保護作用的強度和范圍.因此，本研究以Esat-6為核心，與ESX-Ⅱ～ESX-Ⅴ系統(tǒng)中Esat-6同源蛋白EsxC，EsxH，EsxT，EsxN構建融合抗原AN，避免單一抗原的局限，并進一步探索其是否能夠作為多價亞單位疫苗加強現(xiàn)有BCG的免疫保護效果.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和實驗動物

BCG-Japan(本實驗室保存)；rBCG∶∶AN(本實驗室構建并保存)；E.coliTrans 5α感受態(tài)菌株(北京全式金生物技術有價限公司)；E.coliBL21感受態(tài)菌株(北京全式金生物技術有限公司)；pET-28a(+)表達質粒(Novagen)；Ni-NTA His Bind Resin(Novagen)；佐劑二甲基三十六烷基銨(DDA)和聚肌胞苷酸(polyI：C)購自上海源葉生物技術有限公司；流式細胞檢測相關試劑(BD)；淋巴細胞分離液(Dakewee).5～6周齡雌性BALB/C小鼠(SPF級)、C57BL/6小鼠(SPF級)均購自上海斯萊克實驗動物有限公司.

1.1.2 主要儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀EPS600(天能儀器公司)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(UVP)、超聲破碎儀(新芝儀器)、垂直電泳儀(BIO-RAD)、酶標儀(BioTek)、流式細胞儀(Beckman Gallios)、PCR儀ProFlex TM PCR System(AB Applied Biosystems).

1.2 方法

1.2.1 融合抗原AN表位分析

結核分枝桿菌抗原主要通過組織相容性復合物(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子識別并呈遞給T細胞，抗原中的T細胞表位是能被T細胞受體特異識別的片段，是引起宿主免疫應答的基本功能單位，在疫苗設計、疾病預防和治療中都具有重要意義.我們應用NetMHCcons 1.1 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCcons/)[15]和NetMHCII 2.3 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/ services/NetMHCII/)[16-18]在線網站對融合抗原AN的表位進行預測，綜合分析其作為亞單位疫苗的優(yōu)勢潛力.

1.2.2 目的抗原編碼基因片段克隆

EsxA、EsxC、EsxH、EsxT、EsxN分別是結核分枝桿菌ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ分泌系統(tǒng)的效應蛋白，前期的研究已經證實，EsxA(Esat-6)能夠誘導宿主細胞強烈的免疫反應.為避免單一抗原的局限，將5個基因順序連接構建融合抗原AN：EsxA-EsxC-EsxH-EsxT-EsxN，具體方法如下：

從https：∥mycobrowser.epfl.ch/中獲取結核分枝桿菌H37Rv的基因組信息，設計引物分別對EsxA(Rv3875)、EsxC(Rv3890c)、EsxH(Rv0288)、EsxT(Rv3444c)、EsxN(Rv1793)編碼基因進行擴增，PCR反應體系：32μL水，5×buffer10μL，DNA Polymerase 1μL，上下游引物各1μL，4μL dNTPs，2μL H37Rv基因組模板.用AxyPerpTM DNA Gel Extraction Kit試劑盒回收PCR反應產物.回收后的5個DNA片段利用融合PCR的方法順序連接.為了保證每個抗原表位的天然構象，最大程度提供天然抗原的免疫原性，通過一段9個氨基酸的柔性Linker序列(GGACTAGTACCCCGAGGATCAACAGGA)[19]將5個抗原組分順次連接，得到片段長度為1557bp的融合序列AN.PCR擴增AN片段，并在片段兩端引入合適酶切位點，通過酶切連接將AN片段連至載體pET-28(a)，轉化克隆菌株E.coliTrans 5α，經抗性篩選后進行測序驗證.

表1 融合片段AN擴增所需引物設計Tab.1 Primers designed for AN amplification

1.2.3 AN抗原的原核表達

將測序驗證成功的含有AN片段的重組質粒轉入E.coliBL21表達菌株中，抗性篩選陽性克隆后接種于LB培養(yǎng)基中(含卡那霉素50μg/mL).過夜活化后按照0.1%進行轉接，220r/min，37℃搖床培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L誘導表達4h，收集菌體超聲裂解，離心后將上清、沉淀分別制樣，通過10%SDS-PAGE凝膠電泳分析表達水平.

擴大培養(yǎng)至1L LB培養(yǎng)體系，IPTG誘導目標抗原表達4h，12000r/min，1min離心收菌，冰浴超聲裂菌，收集包涵體.包涵體溶于8mol/L脲-PBS中，溶解蛋白用Ni-NTA親和層析柱進行純化，Bradford法定量.并利用anti-His單克隆抗體通過Western-blot對純化的目的蛋白進行驗證.

1.2.4 AN融合抗原免疫原性分析

6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組，每組5只.分別為PBS組、Ag85A組、AN免疫組.其中Ag85A作為陽性對照組，PBS組為陰性對照.

100μL純化后的AN蛋白(10μg)或Ag85A(10μg)分別與100μL弗氏完全佐劑混合，皮下免疫小鼠，200μL/只.在0、2、4周對小鼠共免疫3次，第2、4周時用等體積的相應抗原與弗氏不完全佐劑混合后免疫.陰性對照組注射等體積無菌PBS.

最后一次免疫后4周頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟于200目(約75μm)細胞篩網上研磨，用淋巴細胞分離液(Dakewee)分離脾淋巴細胞并計數，用RPIM1640培養(yǎng)基調整細胞濃度后鋪于24孔板上，每孔1.0×106個細胞，用5μg/mL純化后的相應抗原刺激細胞，PBS組用5μg/mL結核菌素(PPD)刺激細胞.在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h；加入Brefeldin A孵育4h阻斷高爾基體，然后用1μL CD3和CD4熒光抗體(BD)進行細胞表面染色；固定細胞并破膜，再分別用1μL TNF-α，IFN-γ和IL-2抗體進行細胞內染色；用Gallios流式細胞儀(Beckman)檢測多功能CD4+T細胞所占比例.

1.2.5 AN候選亞單位疫苗的配制

選用佐劑DDA、polyI∶C和融合抗原AN構建亞單位疫苗[20-21].DDA用注射用水配制成2.5mg/mL母液，80℃水浴10min，冷卻至室溫；將polyI∶C用生理鹽水溶解至5.0mg/mL；融合蛋白AN用PBS稀釋至0.1mg/mL后推濾；將DAA 100μL(250μg)，polyI∶C 50μL(50μg)，AN蛋白溶液150μL(15μg)充分混合乳化，制成亞單位疫苗，皮下免疫小鼠(200μL/只).

1.2.6 BALB/c小鼠免疫保護實驗

參考姜雯雯等[21]的亞單位疫苗加強免疫方案，將6～8周BALB/c小鼠隨機分為5組：BCG-Japan免疫組，rBCG∶∶AN免疫組，AN亞單位加強組1(BCG-Japan+AN)，AN亞單位加強組2(rBCG∶∶AN+AN)；陰性對照組(PBS).首先用BCG-Japan及rBCG：AN菌株對小鼠進行皮下免疫，初次免疫劑量為100μL 1.0×104/μL的菌體；陰性對照組注射等體積無菌PBS.初次免疫8周后，用AN亞單位疫苗對AN亞單位加強組1(BCG-Japan+AN)，AN亞單位加強組2(rBCG∶∶AN+AN)進行加強免疫，同樣采用皮下免疫方式，免疫劑量200μL/只；BCG-Japan免疫組和rBCG∶∶AN免疫組不做處理.加強免疫4周后用BCG-Pasteur尾靜脈攻毒小鼠，攻毒劑量為每鼠100μL 1.0×105/μL的菌體，攻毒3周后取小鼠脾臟計算載菌量，評估AN對BCG加強免疫保護效果.

2 結 果

2.1 AN融合抗原T細胞表位分析

抗結核免疫反應主要依賴于宿主細胞免疫，因此抗原一級結構中T細胞表位的分布決定其免疫原性的強弱，利用NetMHCcons 1.1 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCcons/)和NetMHCII 2.3 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)分析，結果見圖1.AN在2個數據庫中的19個亞型中共有213個MHC-Ⅰ型受體(包括HLA-A和HLA-B受體)強結合位點(圖1(a))，119個MHC-Ⅱ型受體(HLA-DRB受體)強結合位點(圖1(c))，而單獨的Esat-6蛋白僅有不到30個T細胞受體強結合位點(圖1(e)).AN能夠提供更多的T細胞表位，進一步說明其作為亞單位疫苗的潛力.

2.2 重組蛋白的制備和鑒定

以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，依次擴增EsxA、EsxC、EsxH、EsxT、EsxN編碼基因片段，將5個片段連接后可得到長度為1557bp的AN編碼基因片段，與質粒pET-28(a)經雙酶切后連接，獲得重組質粒，結果如圖2(a)所示.測序驗證插入片段與目標序列一致，證明重組質粒構建成功.

重組質粒在原核表達系統(tǒng)E.coliBL21菌株中能夠穩(wěn)定表達，主要以包涵體形式存在，Ni-NTA柱親和層析純化后，獲得的重組蛋白經10%SDS-PAGE鑒定，蛋白純度>95%(圖2(b)).進一步通過anti-His單克隆抗體對目的蛋白進行驗證，與蛋白分子量標準比較證明目的蛋白成功表達(圖2(c)).

2.3 AN特異性多功能CD4+T細胞分型分析

通過細胞表面染色CD3和CD4圈定CD4+T細胞，然后在胞內染色TNF-α、IFN-γ和IL-2 3個細胞因子，考察CD4+T細胞的不同分型，從免疫細胞質量的角度評估AN抗原激起的宿主細胞免疫水平.結果如圖3所示.

Ag85A是結核分枝桿菌的分泌蛋白Ag85的成分之一，另外兩種包括Ag85B和Ag85C.Ag85A能夠誘導細胞高水平的IFN-γ分泌，是最早進入臨床實驗亞單位疫苗MVA-Ag85A的組成抗原，已有多項研究證實其免疫原性.在這部分研究中將其作為陽性參照抗原來比較AN融合抗原免疫原性.相比于陰性對照PBS組，AN實驗組均能夠誘導顯著高比例的不同亞型CD4+T細胞.值得關注的是，AN能誘導出比陽性對照組Ag85A更高比例的IFN-γ+TNF-α+IL-2-雙陽性CD4+T細胞(即中央記憶細胞)，以及與Ag85A相似比例的IFN-γ+IL-2+雙陽性CD4+T細胞.在單陽性CD4+T細胞中，AN可以誘導高于陽性對照組Ag85A的TNF-α+IFN-γ-IL-2-CD4+T細胞.這一結果表明AN融合抗原具有良好的免疫原性，可以作為構建亞單位疫苗的候選抗原.

2.4 AN亞單位疫苗對BCG初免的加強保護效果分析

BCG菌株因保存、傳代方法不同，在遺傳水平上發(fā)生了顯著變化，已有研究表明BCG菌株之間廣泛的遺傳多樣性與其毒力和保護效果的差異相關.BCG-Japan菌株表面缺失了大量與分枝桿菌毒力相關的脂類PDIMs和PGLs，同時在BCG-Japan中PE/PPE家族的抗原PE19和PPE27的表達是上調的[22]，這使得BCG-Japan一方面表現(xiàn)為較弱毒力，另一方面呈現(xiàn)良好的保護效果.AN中ESAT-6代表分枝桿菌關鍵毒力因子，出于安全性和保護效果的綜合考慮，在BCG-Japan和rBCG∶∶AN免疫的基礎上評估AN作為亞單位疫苗的效果.

BCG初次免疫小鼠8周后，AN亞單位疫苗加強免疫一次，末次免疫4周后，選用高劑量BCG-Pasteur尾靜脈攻毒小鼠[19]，3周后，斷頸處死小鼠，解剖取其脾臟，計算菌落形成單位(CFU)，結果如圖4見第682頁所示.

BCG免疫組、BCG免疫AN加強免疫組，小鼠脾臟細菌含量均顯著低于陰性對照組(6.18lgCFU).各免疫組小鼠的脾臟計數結果(圖4)顯示，與野生型BCG免疫相比，在BCG菌株中表達AN抗原并未顯著提高疫苗保護效果，甚至在野生型BCG初次免疫后用AN加強免疫，僅能降低小鼠脾臟載菌量的27%(5.06lgCFU∶5.20lgCFU).但當采用rBCG∶∶AN初次免疫-AN抗原加強免疫策略后，相比未加強組(5.20lgCFU)小鼠脾臟載菌量降至4.67lgCFU，兩組間差異顯著(t-Test，**，P<0.005).

實驗結果顯示了AN作為亞單位疫苗對rBCG∶∶AN的初次免疫有很好的加強作用.這種免疫保護效果的加強至少持續(xù)4周.AN亞單位疫苗所表現(xiàn)出的抗分枝桿菌保護潛能提示，用AN進行強化免疫可在一定程度上彌補BCG保護效果的不足.

3 討 論

目前，BCG接種仍然是預防結核病的主要手段，但BCG作為抗結核疫苗其保護效果不甚理想，面對全球范圍內仍然嚴峻的結核病現(xiàn)狀，開發(fā)有效的新型抗結核疫苗是人類共同的迫切目標.研究證實，BCG初免-亞單位疫苗加強的抗結核免疫策略可以提高免疫保護效果[24].但是，選擇哪些抗原作為亞單位疫苗的核心成分，一直是亞單位疫苗開發(fā)的核心問題.考慮到單個抗原免疫原性的局限，將多個抗原或抗原表位組合成融合蛋白亞單位疫苗的研究思路被廣泛接受.已進入臨床Ⅱa實驗的H1(Ag85B+Esat-6)、H4(Ag85B+TB10.4)和H56(Ag85B+Esat-6+Rv2660c)都是含有多抗原表位的融合蛋白，與單個抗原比較，這些融合抗原普遍能在動物體內激起更強的Th1型免疫反應[6-7,23]，保護效果也相對更好.作為結核分枝桿菌的早期分泌抗原，ESX-Ⅰ分泌系統(tǒng)的EsxA(Esat-6)蛋白在參與宿主互作方面功能突出[24]，可以通過結核分枝桿菌抗原非依賴性記憶CD8+T細胞和NK細胞來誘導IL-18依賴性IFN-γ分泌[25].與ESX-Ⅰ類似的分泌系統(tǒng)在結核分枝桿菌中共有5套，即ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ，分泌系統(tǒng)效應蛋白Esx之間序列多樣性與T7S系統(tǒng)功能多樣性密切相關.所以，將不同分泌系統(tǒng)中的重要分泌蛋白融合在一起構建成多抗原融合疫苗是本研究的一種新思路.我們將5套ESX分泌系統(tǒng)中的分泌蛋白EsxA、EsxC、EsxH、EsxT、EsxN融合為抗原AN，探索其免疫原性和免疫保護效果.基于Ag85A設計的亞單位疫苗在南非最早進入臨床試驗[10]，雖然未能顯著提高BCG初次免疫后的加強免疫效果，但Ag85A抗原的免疫原性已經得到多項研究的證實.本研究將其作為陽性參照抗原，用其來比較AN融合抗原加強免疫的效果.

結核分枝桿菌感染宿主細胞后，其抗原主要通過組織相容性復合物(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子識別并呈遞給淋巴細胞.抗原T細胞表位是抗原中能被T細胞受體特異識別的線性片段，更是引起免疫應答的基本效應單位，在疫苗設計、疾病預防和治療中都具有重要價值.我們選擇HLA-DRB、HLA-A和HLA-B受體作為分析對象，HLA-DRB可以識別超過90%的已知結核菌抗原表位，刺激更多CD4+T細胞活化，發(fā)揮抗結核的中心反應.HLA-A和HLA-B活化CD8+T細胞發(fā)揮細胞毒效應，有助于胞內菌的清除.分析表明AN具有大量的T細胞表位，有較強的激發(fā)細胞免疫反應的潛力.本研究利用C57BL/6小鼠脾細胞胞內多因子檢測實驗驗證這一序列預測結果.通過ICS實驗可以檢測單細胞內各因子的分泌情況，進而將CD4+T細胞進行分群，能更靈敏、全面地了解宿主細胞免疫水平.Peter Andersen等[23]在H4+IC31的臨床實驗中用該方法驗證亞單位疫苗的免疫原性，檢測外周血中的T細胞反應水平，取得了與預期相符的結果.本研究結果證明AN抗原能激起高于或接近Ag85A的Th1型細胞因子分泌，可以作為構建亞單位疫苗的候選抗原.

利用BALB/c小鼠在BCG-Japan和rBCG∶∶AN初次免疫的基礎上，評估AN對于BCG初次免疫的加強保護效應，發(fā)現(xiàn)單次AN加強免疫能夠增強重組BCG rBCG∶∶AN的保護效果，表現(xiàn)為小鼠脾臟載菌量大幅下降.值得注意的是，本研究選擇了2株BCG疫苗株分別進行初次免疫，一株是BCG Japan野生型菌株，AN亞單位疫苗加強免疫一次并不能提高其免疫保護效果；但若以增強表達AN抗原的重組BCG Japan菌株rBCG∶∶AN進行初次免疫(本課題組前期構建，能夠分泌表達AN抗原)，則AN加強免疫一次后，就能導致脾臟細菌清除率增加70.2%，證明了AN亞單位疫苗具有抗結核分枝桿菌感染的加強免疫能力，同時也暗示，AN抗原增強保護免疫的效果，與抗原使用劑量、持續(xù)表達時間、免疫次數等免疫策略相關.本項目接下來開展的研究，將重點優(yōu)化AN亞單位疫苗的免疫策略，在此基礎上深入解析其免疫保護機制，充分發(fā)揮這一抗原的亞單位疫苗保護效果.