吳 晉，方 佳，蔡星星，盧寶榮

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

莽草酸循環(huán)(shikimic acid cycle)廣泛存在于所有植物以及多種微生物中，是碳水化合物代謝和次生代謝的重要中轉(zhuǎn)站，并為其他次生代謝的途徑提供底物[1-2].莽草酸途徑的產(chǎn)物是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，而苯丙氨酸和酪氨酸是木質(zhì)素合成的重要前體物質(zhì)[3].木質(zhì)素合成一般由苯丙氨酸和酪氨酸經(jīng)過一系列合成途徑形成木質(zhì)素單體，再由這些木質(zhì)素單體聚合而形成成熟的木質(zhì)素多聚物[4].通常根據(jù)不同木質(zhì)素單體的形成，可以將其分為3種：對(duì)羥基苯基木質(zhì)素(H-木質(zhì)素)，愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(S-木質(zhì)素)，而這3種木質(zhì)素對(duì)應(yīng)來源的3種單體分別是：對(duì)香豆醇，松柏醇和芥子醇[5-6](圖1).通常在單子葉植物中，G-木質(zhì)素的含量最高，約占木質(zhì)素總量的42%～80%[7-8].

木質(zhì)素是自然界含量較豐富的芳香族高聚物，僅次于纖維素的含量[9-10]，主要存在于植物次生結(jié)構(gòu)中，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分之一，其中以次生組織中導(dǎo)管與管胞等結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素含量最高[11].木質(zhì)素填充于細(xì)胞壁中，大大加強(qiáng)了細(xì)胞壁的硬度，使植物細(xì)胞獲得了一定的機(jī)械強(qiáng)度和抗壓能力，有利于植物水分的運(yùn)輸及細(xì)胞生理和結(jié)構(gòu)的變化[12].因此，木質(zhì)素有益于植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，對(duì)于支撐植物的軀干、抗病、抗逆等有著不可缺少的作用[13].此外，近年來的研究表明，高含量的植物木質(zhì)素對(duì)于能量轉(zhuǎn)化效率也具有重要作用，因此提高木質(zhì)素的含量在生物能源的挖掘與利用中具有潛在的重要價(jià)值[14].

EPSPS(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)是莽草酸循環(huán)途徑中第六步的關(guān)鍵酶，當(dāng)EPSPS的作用受到抑制時(shí)，莽草酸途徑會(huì)中斷，從而影響植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，最終導(dǎo)致植物死亡，這也是草甘膦除草劑的除草作用機(jī)制[15].在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)EPSPS酶的轉(zhuǎn)基因栽培稻，其EPSPS轉(zhuǎn)基因漸滲到雜草稻和野生稻群體之后，在不施用草甘膦除草劑的環(huán)境中，含轉(zhuǎn)基因雜種后代群體的適合度相關(guān)性狀如光合速率、單株分蘗數(shù)、單株穗數(shù)、單株種子數(shù)等均有顯著增加[16-17].因此，過表達(dá)EPSPS基因是否會(huì)增加轉(zhuǎn)基因植株的總體生物量？是否會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物中木質(zhì)素總含量的增加以及3種不同類型的木質(zhì)素(H-、G-、S-木質(zhì)素)含量的比例關(guān)系改變？這些都是等待人們?nèi)ソ沂镜挠幸饬x科學(xué)問題.此外，木質(zhì)素合成途徑是由芳香族氨基酸中的苯丙氨酸、酪氨酸經(jīng)過脫氨基等反應(yīng)生成肉桂酸、對(duì)香豆酸及其羥基和甲羥基衍生物的輔酶A酯等組分，這些輔酶A酯類再經(jīng)一系列還原反應(yīng)生成木質(zhì)素的主要3種單體，并經(jīng)過糖基化反應(yīng)后運(yùn)輸?shù)较嚓P(guān)部位組織，最后經(jīng)氧化聚合生成木質(zhì)素[18].因此，如果轉(zhuǎn)基因植株中的木質(zhì)素含量有顯著增加，過表達(dá)EPSPS基因是否會(huì)對(duì)合成木質(zhì)素途徑中相關(guān)代謝產(chǎn)物的基因表達(dá)(見圖1中有問號(hào)的部分)產(chǎn)生影響？這也是有待揭示的科學(xué)問題.

研究表明，禾本科植物中的G-木質(zhì)素的含量最高(42%～80%)，在G-木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶共有8個(gè)：苯丙氨酸脫氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、酪氨酸脫氨酶(TAL)、咖啡酸-5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)、肉桂醇脫氫酶(CAD)和過氧化物酶(POD)(圖1).但是，過表達(dá)EPSPS基因是否會(huì)影響轉(zhuǎn)基因栽培稻×雜草稻和轉(zhuǎn)基因栽培稻×野生稻雜種群體PAL、C4H、TAL、COMT、4CL、CCR、CAD和POD基因的表達(dá)水平，以及該通路上的代謝物(如苯丙氨酸，酪氨酸，阿魏酸)含量變化，仍屬未知.

因此，本文希望回答以下科學(xué)問題：(1) 過表達(dá)EPSPS基因是否增加栽培稻×雜草稻/野生稻雜種后代的總體生物量?(2) 過表達(dá)EPSPS基因是否提高栽培稻×雜草稻/野生稻雜種后代的木質(zhì)素含量，特別是G-木質(zhì)素含量?(3) 過表達(dá)EPSPS基因是否會(huì)引起雜種后代木質(zhì)素合成途徑中與G-木質(zhì)素相關(guān)的重要代謝產(chǎn)物和基因表達(dá)量變化？上述研究的結(jié)果，有助于進(jìn)一步解析莽草酸循環(huán)途徑對(duì)于木質(zhì)素合成的關(guān)鍵作用，也可以為利用EPSPS基因過表達(dá)提高木質(zhì)素產(chǎn)量、優(yōu)化生物能源資源的挖掘提供理論依據(jù)和策略.

1 材料和方法

1.1 材料

本研究中所選用的材料為通過轉(zhuǎn)基因獲得的過表達(dá)EPSPS栽培稻(EP3，父本)與雜草稻(母本)的雜交分離F3后代(WE1和WE2)以及EP3與野生稻(母本)雜交分離產(chǎn)生的F3后代(WR1和WR2)(圖1，表1).實(shí)驗(yàn)材料WE1，WE2，WR1和WR2的獲得過程為，轉(zhuǎn)基因栽培稻與雜草稻/野生稻人工雜交后，經(jīng)自交分離獲得F3代轉(zhuǎn)基因陽性(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)與陰性群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)(表1，圖2，見第668頁).

表1 本研究的實(shí)驗(yàn)材料與特征描述 Tab.1 Experimental materials and their characters used in this study

1.2 方法

1.2.1 植株生物量測(cè)定

生物量是以植株的總干重來衡量的.F3轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)和陰性群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)中分別隨機(jī)選出20粒種子，一共160粒種子，萌發(fā)30d后，檢測(cè)所有植株的生物量.植株總干重的檢測(cè)方法為：收集供試材料全株于105℃下烘1h，然后用60℃烘干至恒重，再稱量每株材料的重量.

1.2.2 木質(zhì)素含量測(cè)定

各樣品木質(zhì)素總含量(m總木質(zhì)素)測(cè)定包含3個(gè)步驟：(1) 木質(zhì)素含量占干物質(zhì)比例(K木質(zhì)素)；(2) 木質(zhì)素的吸光率(A木質(zhì)素)；(3) 根據(jù)(1)和(2)計(jì)算各樣品木質(zhì)素總含量.具體步驟如下：

(1) 隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因栽培稻×雜草稻雜種F3后代(WE1++，WE2++，WE1--和WE2--)及轉(zhuǎn)基因栽培稻×野生稻雜種F3后代(WR1++，WR2++，WR1--和WR2--)30d水培幼苗各5株，取整株幼苗于105℃下烘1h，然后用60℃烘干至恒重，將樣品混合磨碎后稱量并記下總質(zhì)量(m1)；將烘至恒重的砂芯坩堝稱量并記錄其質(zhì)量(m2)；將混合樣品放入燒杯中，加入足量72% H2SO4后用玻璃棒攪拌，室溫靜置4h，將混合液移至1000mL三角瓶中，加入蒸餾水765mL在電爐上回流煮沸2h，再用已烘至恒重的坩堝抽濾混合液，然后用200mL熱水洗滌濾渣3次，將稱有濾渣的坩堝在105℃下烘干至恒重并稱量(m3).

重復(fù)測(cè)定3次，獲得平均木質(zhì)素含量比例：K木質(zhì)素=(m3-m2)/m1×100%.

(2) 隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因栽培稻×雜草稻雜種F3后代(WE1++，WE2++，WE1--和WE2--)及轉(zhuǎn)基因栽培稻×野生稻雜種F3后代(WR1++，WR2++，WR1--和WR2--)30d水培幼苗各5株，取整株幼苗于105℃下烘1h，然后用60℃烘干至恒重，稱量每株幼苗的質(zhì)量(m)；將上述幼苗材料及m3研磨成粉末后，分別稱取粉末0.005g放入20mL試管中，加入25%溴乙酰-乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))2.5mL和高氯酸0.1mL，將試管口密封；在70℃下恒溫水浴30min，每隔10min振蕩試管；將反應(yīng)液移入到裝有3mL冰乙酸和1mL 2mol/L NaOH的容量瓶中，混勻后用冰乙酸定容至10mL(V)；以冰乙酸作為空白對(duì)照，用NanoDrop2000c超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量溶液在280nm波長(zhǎng)處吸光值(OD280，讀數(shù)大于1時(shí)需要用冰乙酸適當(dāng)稀釋).

重復(fù)測(cè)定3次，獲得平均木質(zhì)素含量吸光率：A總木質(zhì)素=OD280×V/(m×K總木質(zhì)素).

以獲得的K木質(zhì)素和A木質(zhì)素為標(biāo)準(zhǔn)值，以各樣品(20株)定容至10mL(V)測(cè)得的OD280值，計(jì)算木質(zhì)素總含量：m總木質(zhì)素=OD280樣品×V/A總木質(zhì)素.

3種不同木質(zhì)素(H-、G-、S-木質(zhì)素)含量測(cè)定步驟：從雜種F3轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)和陰性群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)30d的水培幼苗中，分別隨機(jī)選出18株，每樣品包含6株(混樣)，3次重復(fù)；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)3種木質(zhì)素含量分別進(jìn)行測(cè)定.根據(jù)各樣品和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比，計(jì)算各樣品中3種木質(zhì)素的含量.

1.2.3 苯丙氨酸和酪氨酸的相對(duì)含量測(cè)定

雜種F3轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)和陰性群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)水稻種子萌發(fā)30d后，分別隨機(jī)選出18株水培幼苗，6株混樣，共3個(gè)重復(fù)，一共144株植株，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)苯丙氨酸和酪氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)含量.計(jì)算方法：以陰性群體的苯丙氨酸和酪氨酸含量為1來換算陽性群體的相對(duì)含量.色譜條件：采用ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，進(jìn)樣量5μL，柱溫40℃，流動(dòng)相A—含0.1%甲酸和0.1%七氟丁酸的乙腈，流動(dòng)相B—0.1%甲酸水，流速0.2mL/min；梯度洗脫程序如下：0～1.5min，5%A；1.5～2min，5%～20%A；2～7min，20%～30%A；7～8.5min，30%～98%A；8.5～10.5min，98%A；10.5～11min，98%～5%A；11～12.5min，5%A.質(zhì)譜條件：電噴霧電離(ESI)源，正離子電離模式.離子源電壓3200V，溶劑溫度380℃，錐孔電壓20V.采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行掃描.

1.2.4 阿魏酸的相對(duì)含量測(cè)定

雜種F3轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)和陰性群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)水稻種子萌發(fā)30d后，分別隨機(jī)選出18株水培幼苗，6株混樣，3個(gè)重復(fù)，一共144單株，采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)含量，計(jì)算方法：以陰性群體的阿魏酸含量為1來換算陽性群體的相對(duì)含量.色譜條件：Agilent Zorbax 300Extend-C18色譜柱，進(jìn)樣量10μL，柱溫35℃，流動(dòng)相A—1%乙酸水溶液，流動(dòng)相B—甲醇，流速1.0mL/min，選用325nm色譜波長(zhǎng)，采用等梯度洗脫，0～25min，90%A，10%B.

1.2.5 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

雜種F3轉(zhuǎn)基因陽性(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)和陰性群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)，在水稻種子萌發(fā)水培30d后，分別隨機(jī)選出18株水培幼苗，6株混樣，3個(gè)重復(fù)，一共144單株.本研究選擇的目標(biāo)基因分別編碼苯丙氨酸脫氨酶(PAL)、酪氨酸脫氨酶(TAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、咖啡酸-5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)、阿魏酸-5-羥基化酶(F5H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)、肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)、肉桂醇脫氫酶(CAD)、過氧化物酶(POD).本研究使用天根公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒DP432提取水稻葉片總RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，以水稻總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物，引物見表2.熒光定量PCR反應(yīng)體系為：總體積20μL，2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10μL，引物F(5μmol/L)0.8μL，引物R(5μmol/L)0.8μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4μL，cDNA模版2μL，ddH2O 6.0μL.熒光定量PCR反應(yīng)在ABI 7500序列擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：50℃ 5 min；95℃ 5s，58℃ 30s，72℃ 40s共40個(gè)循環(huán).

表2 熒光定量檢測(cè)木質(zhì)素合成通路中關(guān)鍵基因的引物Tab.2 Primer pairs for quantitative detection of key gene expression in lignin biosynthesis pathway by fluorescence

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

本研究中采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析EPSPS轉(zhuǎn)基因?qū)υ耘嗟九c雜草稻/野生稻雜交后代生物量干重、木質(zhì)素總含量、不同木質(zhì)素含量及比例，木質(zhì)素合成途徑中代謝物含量以及木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響.本研究中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析軟件采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 19.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)EPSPS基因陽性與陰性雜種群體的生物量

生物量(干重)的檢測(cè)結(jié)果表明，在種子萌發(fā)后30d的水稻幼苗期，過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1，WE2)以及野生稻(WR1，WR2)4個(gè)雜交組合的F3后代分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)的生物量均顯著高于陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)，并且大部分組合的差異達(dá)到了極顯著水平(圖3).

在種子萌發(fā)后30d的水稻幼苗期，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)的生物量是對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)的1.28倍、1.22倍、1.41倍、1.26倍，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因陰性群體分別提高了28.0%、21.8%、41.2%、26.1%.這一結(jié)果表明，過表達(dá)EPSPS基因增加了栽培稻與雜草稻/野生稻雜交后代中含有過表達(dá)EPSPS基因群體(個(gè)體)的生物總量或干物質(zhì)總質(zhì)量.

2.2 轉(zhuǎn)EPSPS基因陽性與陰性雜種群體的木質(zhì)素含量

利用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量木質(zhì)素含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在種子萌發(fā)后30d的水稻幼苗期，含過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1，WE2)以及野生稻(WR1，WR2)4個(gè)雜交組合的F3分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)群體的木質(zhì)素總質(zhì)量顯著高于其對(duì)應(yīng)的陰性(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)對(duì)照群體.轉(zhuǎn)基因陽性群體的木質(zhì)素總質(zhì)量分別為3.08mg、2.76mg、4.47mg、3.05mg；而轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體的木質(zhì)素總質(zhì)量分別為2.32mg、2.13mg、2.93mg、2.42mg，相較之下轉(zhuǎn)基因陽性群體的木質(zhì)素總含量分別提高了24.5%、22.7%、34.4%、20.7%(圖4).

同樣，在30d的水稻幼苗期，轉(zhuǎn)基因陽性(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)群體的S-木質(zhì)素和G-木質(zhì)素含量均顯著高于其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)對(duì)照群體的含量(圖5(a),(b))，但是H-木質(zhì)素的含量在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性群體之間沒有顯著差異(圖5(c)).通過計(jì)算，得出轉(zhuǎn)基因陽性群體幼苗中的S-木質(zhì)素含量分別是對(duì)應(yīng)陰性群體的1.58倍、1.82倍、2.28倍和1.96倍；而轉(zhuǎn)基因陽性群體的G-木質(zhì)素含量分別是對(duì)應(yīng)陰性群體的1.49倍、1.99倍、2.34倍和2.41倍(圖5(c)).另外，分析結(jié)果還表明，H-、G-和S-木質(zhì)素含量的比例關(guān)系在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性雜種群體之間并未發(fā)生顯著變化.

2.3 轉(zhuǎn)EPSPS基因陽性與陰性雜種群體的苯丙氨酸、酪氨酸和阿魏酸含量

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)苯丙氨酸和酪氨酸檢測(cè)結(jié)果表明，在種子萌發(fā)后30d的水稻幼苗期，轉(zhuǎn)過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1)以及野生稻(WR2)兩個(gè)雜交組合的F3分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++和WR2++)的苯丙氨酸和酪氨酸的含量均顯著高于其對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照群體(WE1--和WR2--).但另1個(gè)含過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與野生稻(WR1)的雜交組合F3分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WR1++)的苯丙氨酸和酪氨酸的含量與其陰性對(duì)照群體(WR1--)相比沒有顯著差異(圖6).檢測(cè)到的轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++、WR1++和WR2++)中苯丙氨酸質(zhì)量分別為32.15μg、55.07μg、15.01μg，而其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性群體(WE1--、WR1--和WR2--)中苯丙氨酸質(zhì)量分別為21.89μg、49.81μg、8.94μg.同時(shí)，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++、WR1++和WR2++)中酪氨酸的質(zhì)量分別為18.17μg、27.64μg、8.50μg，而其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性群體(WE1--、WR1--和WR2--)中酪氨酸的質(zhì)量分別為13.32μg、26.65μg、5.40μg.

轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++、WR1++和WR2++)的苯丙氨酸含量是其相應(yīng)轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--、WR1--和WR2--)的1.47倍、1.11倍和1.68倍，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因陰性群體分別提高了46.9%、10.5%和67.8%；轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++、WR1++和WR2++)的酪氨酸含量是其轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--、WR1--和WR2--)的1.36倍、1.04倍和1.58倍，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因陰性群體分別提高了36.4%、3.7%、57.5%(表3).

表3 雜種后代(F3)中EPSPS轉(zhuǎn)基因陽性與陰性群體的木質(zhì)素合成途徑上基因的相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression of eight genes in lignin synthesis pathway between EPSPS transgenic and non-transgenic progeny derived from EPSPS cultivated rice and weedy/wild rice hybrids

采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)阿魏酸檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1，WE2)以及野生稻(WR1，WR2)4個(gè)雜交組合的F3分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)的阿魏酸含量均顯示近顯著(+)或者顯著(*)高于其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)(圖7).

轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)阿魏酸的質(zhì)量分別為0.3061μg、0.2736μg、2.5575μg、0.4097μg；其對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)阿魏酸的質(zhì)量分別為0.2170μg、0.1586μg、1.0830μg、0.2530μg.轉(zhuǎn)基因陽性群體的阿魏酸質(zhì)量分別是其對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體的1.41倍、1.73倍、2.36倍、1.62倍，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因陰性群體分別提高了41.1%、72.5%、136.2%、61.9%(圖7).

2.4 轉(zhuǎn)EPSPS基因陽性與陰性雜種群體的木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達(dá)量

熒光定量檢測(cè)木質(zhì)素合成通路上相關(guān)基因表達(dá)量的結(jié)果表明，在含過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1，WE2)以及野生稻(WR1，WR2)4個(gè)雜交組合的F3分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)的木質(zhì)素合成通路上相關(guān)基因的表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)相比均有不同程度的上調(diào)(表3).

木質(zhì)素合成途徑中8個(gè)基因(圖1)的相對(duì)表達(dá)量分別是：苯丙氨酸脫氨酶基因(PAL)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合(WE1、WE2、WR1、WR2)中分別提高了2.45倍、1.18倍、8.06倍和2.75倍；肉桂酸-4-羥基化酶基因(C4H)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別提高了2.68倍、2.72倍、5.81倍和2.59倍；酪氨酸脫氨酶基因(TAL)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別是轉(zhuǎn)基因陰性群體的0.30倍、1.61倍、1.55倍、0.87倍；咖啡酸-5-羥基阿魏酸-O- 甲基轉(zhuǎn)移酶基因(COMT)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別提高了10.50倍、2.48倍、2.58倍和1.26倍；4- 香豆酸輔酶A連接酶基因(4CL)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別提高了2.10倍、1.65倍、1.58倍和3.02倍；肉桂酰輔酶A還原酶基因(CCR)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別是轉(zhuǎn)基因陰性群體的1.54倍、2.80倍、0.98倍、1.23倍；肉桂醇脫氫酶基因(CAD)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別提高了3.97倍、1.09倍、1.04倍和2.29倍(表3).

值得注意的是，過氧化物酶基因(POD)的表達(dá)量在4個(gè)雜交組合中分別提高了2.03倍、2.94倍、3.70倍和1.89倍(表3)，而且含過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1，WE2)以及野生稻(WR1，WR2)4個(gè)雜交組合的F3陽性群體中(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)，POD的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于其轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--)(圖8).

3 討 論

本研究的一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在含過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻(WE1，WE2)/野生稻(WR1，WR2)4個(gè)組合雜交后代的F3分離群體中，轉(zhuǎn)基因陽性群體(WE1++，WE2++，WR1++和WR2++)的生物量和木質(zhì)素含量(總含量、G-木質(zhì)素、S-木質(zhì)素)均顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照群體(WE1--，WE2--，WR1--和WR2--).上述研究結(jié)果明確地回答了本文提出的第1和第2個(gè)問題，即過表達(dá)EPSPS基因可以提高抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因栽培稻與其野生近緣種雜種后代的生物量和木質(zhì)素含量.

前期的研究表明，轉(zhuǎn)基因栽培稻中過表達(dá)EPSPS基因漸滲到雜草稻群體中后，不僅提高了含有轉(zhuǎn)基因雜種后代群體抗草甘膦除草劑的能力，而且還顯著提高了適合度相關(guān)性狀表現(xiàn)，如光合速率、分蘗能力、單株穗數(shù)和種子數(shù)等[16]，在轉(zhuǎn)基因栽培稻與野生稻雜種后代群體以及轉(zhuǎn)EPSPS擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[17,20].本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)EPSPS基因可以提高雜種后代的生物量與木質(zhì)素含量，表明過表達(dá)不同來源的EPSPS基因可能為植物帶來適合度的利益，提高植物的生存競(jìng)爭(zhēng)能力，有利于植物的生長(zhǎng)繁殖與擴(kuò)張.另外，由于木質(zhì)素可以提高植物的機(jī)械支撐強(qiáng)度，并且在抗逆、抗病方面有重要作用[18,21-22]，木質(zhì)素合成過程中產(chǎn)生的一些酚類和自由基也有利于提高植物的自我防御能力[23-24].因此，上述研究結(jié)果不僅可以從分子水平解釋轉(zhuǎn)EPSPS基因植物適合度優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的原因，而且還提示過表達(dá)EPSPS轉(zhuǎn)基因的生物安全評(píng)價(jià)值得重視.因?yàn)樵撧D(zhuǎn)基因一旦通過基因漂移從轉(zhuǎn)基因作物漸滲到它們的野生近緣種群體，就可能因其適合度優(yōu)勢(shì)帶來潛在的非預(yù)期生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[25-30].

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)過表達(dá)EPSPS基因栽培稻與雜草稻的雜種F3后代(WE1)以及與野生稻的雜種后代(WR2)中，含轉(zhuǎn)基因雜種群體的苯丙氨酸和酪氨酸含量比陰性對(duì)照顯著增加，阿魏酸含量也有不同程度的增加，表明過表達(dá)莽草酸途徑中EPSPS酶，可以在很大程度上影響其下游相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量.同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EPSPS基因還影響了轉(zhuǎn)基因栽培稻與雜草稻以及野生稻雜種后代G-木質(zhì)素合成通路上相關(guān)基因的表達(dá)量，即轉(zhuǎn)基因陽性群體中一系列與木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的陰性群體相比較均有不同程度的上調(diào)，其中過氧化物酶基因(POD)的表達(dá)量在所有轉(zhuǎn)基因陽性雜種群體中都表現(xiàn)出顯著上調(diào).上述結(jié)果回答了本文提出的第3個(gè)問題，即過表達(dá)EPSPS基因可以在很大程度上影響木質(zhì)素合成通路上相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量和基因的表達(dá)量.前人的研究表明，過氧化物酶(POD)通過催化不同木質(zhì)醇單體發(fā)生脫氫聚合反應(yīng)，并且參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁的聚合過程而使細(xì)胞壁的伸展性發(fā)生改變，這對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定的調(diào)節(jié)作用[19].本研究也證實(shí)POD是G-木質(zhì)素合成過程中的一個(gè)非常關(guān)鍵的酶.

木質(zhì)素作為植物在自然環(huán)境中存在的第二大聚合物，不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用，也是重要的生物能源代謝庫(kù)[14].眾所周知，廣義的生物質(zhì)能源大致包括3種不同的利用方式：(1) 植物的直接燃燒；(2) 生物能的轉(zhuǎn)化，包括農(nóng)作物秸稈氣化和沼氣利用；(3) 生物液體燃料，生物乙醇和生物柴油.木質(zhì)素是一種儲(chǔ)量大、可再生以及環(huán)境友好的自然資源，利用可再生自然資源生產(chǎn)燃料乙醇也正在引起科研工作者的更廣泛關(guān)注[9,31-32]，木質(zhì)素經(jīng)加工處理后作為能量及材料來源的應(yīng)用前景巨大.本研究發(fā)現(xiàn)的過表達(dá)內(nèi)源或外源的EPSPS基因，具有顯著提高植物生產(chǎn)木質(zhì)素潛力的現(xiàn)象與機(jī)理，為將來生物能源的資源創(chuàng)新和生產(chǎn)應(yīng)用，特別是通過轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)和基因編輯技術(shù)來提高木質(zhì)素產(chǎn)量，提供了一種新的重要策略和方法.

綜上所述，木質(zhì)素是自然界中含量豐富的芳香族高聚物，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有非常重要的作用.揭示過量表達(dá)內(nèi)源或外源EPSPS基因在木質(zhì)素合成途徑中如何影響植物相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化以及基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)，不僅可以為后續(xù)有關(guān)木質(zhì)素合成的進(jìn)一步研究提供很好的借鑒，也有益于更好利用這一過程來提高木質(zhì)素的產(chǎn)量，發(fā)揮其在生物能源開發(fā)與利用中的作用.另外，過量表達(dá)EPSPS基因可以為轉(zhuǎn)基因植物帶來適合度優(yōu)勢(shì)，這一類轉(zhuǎn)基因一旦通過基因漂移從栽培植物漸滲到野生近緣種群體中，也可能導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，必須重視在商品化應(yīng)用中對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的環(huán)境安全評(píng)價(jià).