姜希紅，張 爽，劉樹(shù)民

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱150040）

林蛙油（Oviductus ranae, OR）是成熟雌性林蛙的干燥輸卵管，又稱哈蟆油、哈士蟆油、雪蛤油。對(duì)于林蛙油的基原問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議，目前的研究認(rèn)為其基原動(dòng)物應(yīng)為東北林蛙，中國(guó)林蛙為其同物異名[1]。林蛙油性味甘、咸、平，是我國(guó)著名的傳統(tǒng)動(dòng)物藥，從明清時(shí)期就用于治療或預(yù)防各種疾病，包括病后體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗、癆嗽咳血，更年期綜合征等。近年來(lái), 隨著林蛙油市場(chǎng)需求量的逐漸增大，林蛙油價(jià)格也上漲很多，一些投機(jī)者開(kāi)始銷售偽品林蛙油，主要的偽品有青蛙油、牛蛙油、蟾蜍油，因此，研究準(zhǔn)確有效的林蛙油真?zhèn)舞b別方法十分必要。林蛙油的傳統(tǒng)鑒別方法有基源鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別等，現(xiàn)代鑒別方法包括儀器鑒別法、分子生物學(xué)方法，本文對(duì)林蛙油中的主要化學(xué)成分及其鑒別方法總結(jié)概括, 以期為準(zhǔn)確、快速鑒別真?zhèn)瘟滞苡偷难芯刻峁椭?/p>

1 林蛙油化學(xué)成分

1.1 蛋白質(zhì)和氨基酸

蛋白質(zhì)和氨基酸是林蛙油中的主要活性成分，林蛙油中富含蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量可高達(dá)50%以上。對(duì)于林蛙油蛋白成分的研究，最早是由日本學(xué)者久保田晴光開(kāi)展。劉春娟[2]等根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的不同，從林蛙油粉末中分離出水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白4 種可溶性組分蛋白，并進(jìn)行了相關(guān)的抗氧化活性試驗(yàn)。

目前，已鑒定的林蛙油中氨基酸的種類有18種，分別為天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸。其中人體必需、半必需氨基酸10 種。杜景新等[3]將林蛙皮、骨、肝、卵、活性油等部位氨基酸含量進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)背皮中氨基酸含量最低，但仍比30 年野山參含必需氨基酸的量高4 倍多，可見(jiàn)林蛙全身都具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。

1.2 多糖

多糖也是林蛙油中具有生物活性的主要成分之一。鄭衛(wèi)星等[4]通過(guò)SPSS 軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定中性蛋白酶水解法提取林蛙油多糖的最佳工藝參數(shù)，最終多糖得率為10.4%。楊靖等[5]對(duì)比了胃蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶3 種酶對(duì)林蛙油多糖得率的影響，結(jié)果表明，胰蛋白酶酶解得到的蛋白得率較其他兩者高，并且酶解的更徹底，在此基礎(chǔ)上確定了多糖的最佳提取工藝，并且發(fā)現(xiàn)林蛙油多糖具有顯著的抗疲勞活性。

1.3 不飽和脂肪酸

林蛙油中脂肪酸的研究逐漸增多，尤其是對(duì)不飽和脂肪酸的研究，不飽和脂肪酸是合成前列腺素所必須的前體，對(duì)心腦血管具有保護(hù)作用。范玉林[6]等對(duì)林蛙油不飽和脂肪酸進(jìn)行分析研究，得到10-十一碳烯酸、9-十六碳烯酸、11-十八碳烯酸、5, 8,11, 14-二十碳四烯酸、7-九碳烯酸5 種不飽和脂肪酸；楊淑琴[7]等對(duì)哈蟆油脂肪酸進(jìn)行測(cè)定，其中的不飽和脂肪酸十六碳烯酸、十六碳二烯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸（DPA）、二十二碳六烯酸（DHA）占脂肪酸的73.38%，于桂芳[8]等采用HPLC 法對(duì)林蛙油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸含量進(jìn)行測(cè)定，其中亞油酸及α-亞麻酸是人體不可或缺的必需脂肪酸，該結(jié)果可為林蛙油的質(zhì)量控制提供參考。除以上3 種成分外，EPA 和DHA 具有維持和改善視力，提高記憶、學(xué)習(xí)等能力，抑制老年癡呆癥的生理學(xué)效果，對(duì)林蛙油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立同樣具有一定的參考意義。

1.4 類固醇

類固醇是一種廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)的天然產(chǎn)物，包括皮質(zhì)激素、性激素、膽汁酸、膽固醇等。王永生等[9,10]對(duì)哈蟆油中的類固醇類成分進(jìn)行分析，分離鑒定了膽固醇、十六烷酸膽甾醇酯、膽甾-4-烯-3-酮、膽固醇棕櫚酸酯、膽甾-5-烯-3β，7β-二醇、3β-羥基膽甾-5-烯-7 酮，其中后兩個(gè)成分為首次從哈蟆油中分離得到。徐陽(yáng)[11,12]通過(guò)硅膠和Sephadex LH-20 凝膠柱層析結(jié)合制備液相和高速逆流法對(duì)哈蟆油成分進(jìn)行分離，得到豆甾醇、菜油甾醇、膽甾-4，6-二烯-3-醇、7-去氫膽固醇、膽甾醇、7-羥基膽甾醇和7-酮基膽甾醇，它們的含量對(duì)哈蟆油藥效有直接影響，故可用于哈蟆油鑒別。肖寄平等[13]從哈蟆油中鑒定了膽甾-3-酮、膽甾-3,5 二烯-7-酮、膽甾-4,6 二烯-3-酮、豆甾醇-22,23-二氫、膽甾-8-烯-7-酮等成分。膽甾-5-烯-3-β-醇、膽甾-3，6-二酮也被分離發(fā)現(xiàn)。此外林蛙油的多種藥理作用均與性激素有關(guān)，目前已從林蛙油分離得到的性激素有雌二醇、美屈孕酮、乙酸雄甾酮、睪酮、孕酮等[14]。

1.5 其他激素

除性激素外，林蛙油中還含有其他種類的激素類成分，如前列腺素、甲狀腺素（T3）、甲狀腺旁素（T4）、促絨毛膜性腺激素等[15]。

1.6 維生素及微量元素

維生素與微量元素在林蛙油中含量較豐富。在林蛙油中已發(fā)現(xiàn)的維生素包括維生素A、B1、B2、C、D、E、K 以及β-胡蘿卜素，其中維生素E 的含量最高，并且多種藥理作用均與VE 有關(guān)[15]。目前利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀( ICP-MS)、微波消解-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）、原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法等技術(shù)，已從林蛙油中檢測(cè)出K、Na、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、P、Al、Ba、Ni、Cu、Mo、Co、V、Cr、Pb、As、Se、Cd、Hg 21 種微量元素，有益元素K、Na、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn 的含量均較高，而重金屬元素As、Hg、Cr、Pb 含量較低，均未超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量值，這將為林蛙油的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定的參考價(jià)值[16,17]。

1.7 其他

磷脂是生物膜的主要脂質(zhì)成分，林蛙油中含有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂[18]；采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)林蛙油中核苷類成分肌苷和尿嘧啶提取工藝進(jìn)行研究，為其他核苷類成分提取提供參考，也為林蛙油進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供依據(jù)[19]；2015 版《中國(guó)藥典》將1-甲基海因作為鑒別成分，袁慧雅等[20]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定了不同動(dòng)物類中藥材1-甲基海因含量，其中蛤蟆油中1-甲基海因的含量為4.45μg·g-1。

2 林蛙油的鑒別

2.1 傳統(tǒng)鑒別方法

2.1.1 基源鑒別 外形與青蛙相似，雌蛙體長(zhǎng)為7～9cm。頭部長(zhǎng)與寬幾乎相等，吻端略突出于下頜。鼻孔在吻眼之間，眼間距與上眼瞼等寬，且小于鼻間距，前肢短而后肢較長(zhǎng)，脛長(zhǎng)度長(zhǎng)于體長(zhǎng)一半，有發(fā)達(dá)的蹼, 疣粒分散于脛跗關(guān)節(jié)前達(dá)眼兩側(cè)的褶間，成"V"字形在肩部排列，膚色根據(jù)季節(jié)發(fā)生變化，秋冬季節(jié)為褐色，夏季為黃褐色，腹面皮膚光滑，呈紅黃色，有灰白色斑點(diǎn)塊。背面與體側(cè)有斑點(diǎn)分散，多數(shù)在疣點(diǎn)上，四肢有明顯的橫紋[21]。

2.1.2 性狀鑒別 輸卵管長(zhǎng)為體長(zhǎng)的4～8 倍，重量占體重的20%～26%，彎曲重疊呈不規(guī)則的塊狀或片狀，并且大小不一，大者長(zhǎng)度約1.5～2cm，厚約1.5～3cm，小者同米?；蚨沽４笮　｜S白色，毛細(xì)血管明顯，脂肪樣光澤，偶有灰白色薄膜狀干皮和黑色卵。質(zhì)硬而脆，易折斷。溫水浸泡膨脹度可達(dá)90%以上。膨脹后質(zhì)地軟呈棉團(tuán)狀，氣腥，味微甘，嚼之有粘滑感[21]。

2.1.3 組織學(xué)鑒別

蛤蟆油橫切面 卵圓形或闊卵圓形，顏色為灰紫色，具有較薄的表明結(jié)締組織，并且有間斷，支架明顯，顏色呈粉紅色，但折疊部位顏色較深；小葉呈長(zhǎng)約2000μm，直徑約150μm 的長(zhǎng)方形；有明顯的腺體細(xì)胞及細(xì)胞核，可見(jiàn)深紫色的毛細(xì)血管；內(nèi)壁腺上皮細(xì)胞呈長(zhǎng)徑約40μm，短徑約15μm 的卵形，粉紅色，并且以數(shù)個(gè)為一組，切向排成一列；具有橢圓形的管腔。

蛤蟆油弦切面 有明顯的結(jié)締組織支架，并有血管貫穿其間，多角形的小葉，平均成五角形，長(zhǎng)徑120～250μm，短徑70～200μm。6～8 個(gè)腺體細(xì)胞，排列成放射狀，有明顯的呈藍(lán)紫色的細(xì)胞核[22]。

2.1.4 顯微鑒別 劉娟等[23]取哈蟆油、青蛙油和蟾蜍油經(jīng)過(guò)處理后，進(jìn)行顯微鑒別，通過(guò)對(duì)顏色，腺體紋理，腺體細(xì)胞形狀、直徑大小、排列，細(xì)胞壁形狀、位置等的觀察，對(duì)真?zhèn)喂∮瓦M(jìn)行鑒別。結(jié)果哈蟆油呈黃色或金黃色，腺體細(xì)胞長(zhǎng)方形，直徑25～75μm，細(xì)胞壁明顯，核橢圓形，橫斷面呈管狀，細(xì)胞三角形或梯形。青蛙油，腺體細(xì)胞多五邊形，直徑為37～86μm，細(xì)胞壁明顯，細(xì)胞核橫斷面細(xì)胞類長(zhǎng)方形。蟾蜍油，腺體細(xì)胞形態(tài)不一，直徑為20～52μm，壁不明顯，細(xì)胞核橫斷面呈類圓形。

2.1.5 水試鑒別 對(duì)哈蟆油、青蛙油和蟾蜍油依據(jù)膨脹度測(cè)定法測(cè)定。哈蟆油膨脹度為57，青蛙油膨脹度為45，蟾蜍油膨脹度僅為32[23]。

2.1.6 薄層色譜鑒別 采用薄層色譜法對(duì)哈蟆油、青蛙油和蟾蜍油進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)三者除都含有雌二醇、膽固醇和維生素A 外，分別含其他物質(zhì)6 種、4種、3 種，其他成分區(qū)別明顯，該方法可作為鑒別蛤蟆油的依據(jù)[23]。

2.1.7 熒光鑒別 張琴等[24]觀察在熒光燈365nm波長(zhǎng)下真?zhèn)瘟滞苡偷娘@色情況，發(fā)現(xiàn)正品林蛙油顯黃色熒光，偽品林蛙油顯亮藍(lán)色熒光。

2.2 儀器鑒別方法

2.2.1 紫外光譜法 利用紫外譜線組法，王永生等[25]繪制了蛤蟆油的紫外譜線組圖譜，根據(jù)蛤蟆油、牛蛙油、青蛙油、蟾蜍油的石油醚提取液、三氯甲烷提取液、乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液吸收峰的峰型、數(shù)量、位置的不同以達(dá)到鑒別蛤蟆油真?zhèn)蔚哪康摹?/p>

2.2.2 紅外光譜法 王永生等[26]建立了不同產(chǎn)地正品蛤蟆油的紅外指紋圖譜，在1800～400cm-1范圍內(nèi)的指紋區(qū)吸收峰較多，特征性較明顯，結(jié)果非常接近，所含主成分相似，利用此方法可以快速的對(duì)蛤蟆油進(jìn)行鑒定、分析。

2.2.3 HPLC 指紋圖譜法 黃玉明等[27]選取了15 批正品蛤蟆油及其偽劣品蛤蟆油，對(duì)它們的HPLC 圖譜進(jìn)行分析比對(duì)，計(jì)算每批蛤蟆油的相似度，其中15 批蛤蟆油中，11 批優(yōu)質(zhì)蛤蟆油相似度在0.886～0.972 之間，4 批劣質(zhì)蛤蟆油相似度在0.56～0.802 之間，3 批偽蛤蟆油的藥材相似度在0.64～0.724 之間。最終以相似度0.85 作為評(píng)價(jià)蛤蟆油合格的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

2.2.4 RP-HPLC 指紋圖譜法 Gan 等[28]采用反相高效液相色譜法和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析相結(jié)合的方法，對(duì)正品林蛙油與其偽品牛蛙油、蟾蜍油和青蛙油進(jìn)行鑒別，結(jié)果正品林蛙油的指紋圖譜與偽品具有顯著差異，正品林蛙油30min 左右開(kāi)始出峰，30～80min內(nèi)有12 個(gè)顯著的共有峰，聚類分析正品聚為一類，主成分分析聚集于a 區(qū)。牛蛙油0～30min 內(nèi)出現(xiàn)4個(gè)共有峰，蟾蜍油0～30min 內(nèi)出現(xiàn)3 個(gè)共有峰，30～80min 牛蛙油和蟾蜍油都只出現(xiàn)5 個(gè)共有峰，青蛙油只出現(xiàn)4 個(gè)微小的共有峰；橫坐標(biāo)間隔為10 時(shí)，牛蛙油、蟾蜍油、青蛙油分別聚為一類，為25 時(shí)，正品聚為一類，3 個(gè)偽品聚為一類，牛蛙油、蟾蜍油、青蛙油分別聚集于b 區(qū)、c 區(qū)、d 區(qū)，與聚類分析結(jié)果一致。系統(tǒng)聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）成功地對(duì)正品林蛙油及其偽品進(jìn)行區(qū)分。

2.2.5 凝膠電泳法 黃瑤等[29]分別采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）和十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）兩種凝膠電泳法對(duì)及其類似品，偽品蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油進(jìn)行鑒別，結(jié)果兩種方法得到正品林蛙油與偽品林蛙油的譜帶在特征方面均有顯著差異，且各有特點(diǎn)，Native-PAGE 法蛤蟆油可見(jiàn)6 條特征譜帶，桓仁林蛙油具有6 條特征譜帶，黑龍江林蛙油具有5 條特征譜帶，蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征譜帶數(shù)目分別為2 條、1 條和1 條。SDS-PAGE 法蛤蟆油可見(jiàn)11條特征譜帶，桓仁林蛙油和黑龍江林蛙油均見(jiàn)11 條特征譜帶，蟾蜍油、牛蛙油和青蛙油的特征譜帶數(shù)目分別為5 條、6 條和6 條。兩者均可用于區(qū)別哈蟆油與偽品，Native-PAGE 法還可區(qū)別哈蟆油與類似品黑龍江林蛙油。

2.2.6 凝膠電泳分離液相色譜質(zhì)譜法 林燕等[30]建立了正品林蛙油及偽品特異性蛋白的鑒定方法，采用凝膠電泳分離、蛋白酶酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等技術(shù)，篩選出特異性蛋白，從而有效的鑒別林蛙油的真?zhèn)巍?/p>

2.2.7 基于聚類分析與多元統(tǒng)計(jì)分析的凝膠電泳法 李晶峰等[31]采用SDS-PAGE 法，對(duì)得到的不同批次東北林蛙油及其類似品黑龍江林蛙油、偽品中華蟾蜍油及牛蛙油的電泳圖譜，進(jìn)行聚類分析與多元統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)東北林蛙油及其類似品、偽品的準(zhǔn)確分類及鑒別。

2.3 分子鑒定技術(shù)

2.3.1 快速PCR 法鑒別 何志一等[32]依據(jù)哈蟆油基因設(shè)計(jì)特異性PCR 引物，建立了蛤蟆油及其4 種混偽品的快速PCR 鑒別方法。采用堿裂解法提取每組樣品DNA，并用Chelex-100 對(duì)所提取的基因組DNA 純化，2 步循環(huán)PCR 反應(yīng)，在所建立的方法下，正品顯示明亮綠色熒光，混淆品沒(méi)有熒光。

2.3.2 線粒體COI 序列的DNA 條形碼技術(shù)鑒別 王孟虎等[33]利用DNA 條形碼技術(shù)，建立了中國(guó)、東北、黑龍江和桓仁4 種林蛙的線粒體COI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)種間遺傳距離及種內(nèi)變異位點(diǎn)，準(zhǔn)確的鑒定了4 種林蛙及對(duì)不同地區(qū)的東北林蛙進(jìn)行鑒別，此技術(shù)是哈蟆油基原動(dòng)物鑒定的新手段。

2.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）檢測(cè)及微流控芯片檢測(cè)技術(shù)鑒別 王衛(wèi)芳等[34]研究?jī)煞N新型檢測(cè)方法，LAMP 檢測(cè)具有高速、低成本并且操作方便的特點(diǎn)?；贚AMP 技術(shù)產(chǎn)生的微流控芯片檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)短、靈敏度高、低耗能及低成本，更加便攜化，兩者有望成為分子生物學(xué)檢測(cè)的新手段。

2.3.4 線粒體DNA cytB 鑒定 董瑤等[35]取市售雌蛙的新鮮組織及林蛙油，并提取總DNA，以cytB 為模板設(shè)計(jì)4 對(duì)引物，cytB 分別來(lái)自中國(guó)林蛙、東北林蛙、黑斑蛙及蟾蜍，利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所選市售林蛙組織及林蛙油均來(lái)自東北林蛙，該方法可為林蛙種屬以及林蛙油基源的鑒定提供依據(jù)。

2.3.5 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的差異性鑒別 金媛媛等[36]采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)東北林蛙油、黑龍江林蛙油和市售林蛙油中蛋白質(zhì)的賴氨酸乙?；?、賴氨酸巴豆?；屠野彼崃姿峄剑Y(jié)果3 種林蛙油都出現(xiàn)可用于分析的蛋白質(zhì)條帶，并且在不同的修飾方法中，三者的蛋白條帶信號(hào)強(qiáng)弱均有差異。賴氨酸乙?；揎椝皆跂|北林蛙油中程度較高，市售風(fēng)干林蛙油次之。賴氨酸巴豆酰化修飾水平在東北林蛙油程度較高，市售風(fēng)干林蛙油次之。酪氨酸磷酸化修飾水平在市售風(fēng)干林蛙油程度較高，東北林蛙油次之。該方法可為林蛙油的鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

2.3.6 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）結(jié)合2D LC-MS/MS 技術(shù)鑒別 魏星華等[37]采用iTRAQ與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究哈蟆油與青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油的蛋白質(zhì)組學(xué)，結(jié)合聚類分析、GO 功能注釋和生物信息學(xué)分析結(jié)果，篩選出差異蛋白8 個(gè)，并且哈蟆油與各偽品間蛋白質(zhì)組成差異較大。

3 展望

隨著鑒別技術(shù)的不斷發(fā)展，多種鑒別方法應(yīng)運(yùn)而生，不同的鑒別方法具有各自的特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)際情況選擇鑒別手段。通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)鑒別、儀器鑒別和分子生物學(xué)鑒別方法的總結(jié)，可見(jiàn)分子生物學(xué)方法能夠更加快速準(zhǔn)確的對(duì)林蛙油進(jìn)行鑒別，操作簡(jiǎn)便而高效。目前的檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的特征性成分基本都是蛋白質(zhì)，成分指標(biāo)比較單一，因此，應(yīng)該進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)林蛙油鑒別的特征性、專屬性的其他物質(zhì)。對(duì)于一種檢測(cè)方法不能實(shí)現(xiàn)鑒別目的時(shí), 應(yīng)該繼續(xù)開(kāi)發(fā)檢測(cè)技術(shù), 或?qū)⒍喾N方法聯(lián)合, 結(jié)合多組分多指標(biāo)對(duì)林蛙油進(jìn)行檢測(cè)，以解決林蛙油摻假、以次充好等問(wèn)題，為林蛙油的鑒定以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供更好的方法。當(dāng)然最重要的是，應(yīng)該完善相關(guān)法律法規(guī), 進(jìn)一步提高公民的文化道德素養(yǎng), 從源頭上規(guī)避售假行為，維護(hù)市場(chǎng)健康發(fā)展。