王 康, 崔玉琳, 高政權(quán), 孟春曉, 秦 松

微藻基因工程在高價(jià)值化合物生產(chǎn)上的應(yīng)用

王 康1, 2, 崔玉琳1, 3, 高政權(quán)4, 孟春曉4, 秦 松1, 3

(1. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 煙臺(tái) 264003; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071; 4. 濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264003)

微藻在生產(chǎn)蛋白質(zhì)、油脂、色素等方面具有作為細(xì)胞工廠的潛力, 在解決傳統(tǒng)生物量生產(chǎn)和市場(chǎng)未來(lái)的一些局限性方面發(fā)揮著推進(jìn)作用?；蚬こ檀龠M(jìn)了微藻的改良, 推動(dòng)了微藻的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。本文綜述了近年來(lái)微藻基因工程的研究進(jìn)展以及基因工程在微藻生產(chǎn)生物燃料、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用。本文能為基因工程技術(shù)在微藻中的研究及應(yīng)用提供思路, 從而使微藻以及微藻產(chǎn)品變得更具有經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力。

微藻; 細(xì)胞工廠; 高價(jià)值化合物; 基因工程

微藻是一類分布廣泛的光合自養(yǎng)單細(xì)胞生物的總稱, 包括了許多原核和真核的種類, 它們通過(guò)細(xì)胞代謝可以產(chǎn)生多糖、蛋白質(zhì)、色素、脂質(zhì)等多種高價(jià)值化合物, 這使其在食品保健、醫(yī)藥、生物燃料等領(lǐng)域具有很好的開(kāi)發(fā)前景。微藻的規(guī)?；B(yǎng)殖在解決傳統(tǒng)生物量生產(chǎn)和市場(chǎng)未來(lái)的一些局限性方面發(fā)揮著推進(jìn)作用, 例如, 從微藻中提取高價(jià)值副產(chǎn)品使基于微藻的可再生能源成為經(jīng)濟(jì)可行的選擇[1]。此外, 工業(yè)上用于生物量生產(chǎn)的一些綠藻在國(guó)際市場(chǎng)上被認(rèn)為是安全的, 這說(shuō)明直接以微藻細(xì)胞為原料, 通過(guò)簡(jiǎn)單的處理和加工來(lái)生產(chǎn)微藻產(chǎn)品是可行的[2]。然而, 直接利用微藻生產(chǎn)高價(jià)值化合物較為困難且產(chǎn)量低[3], 這使得大多數(shù)的微藻產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益低下。為了改變這一現(xiàn)狀, 通過(guò)基因工程技術(shù)引入外源基因來(lái)提高細(xì)胞代謝物的含量已經(jīng)成為高產(chǎn)藻株選育的一種重要的手段。本文綜述了微藻基因工程的研究進(jìn)展及基因工程在高價(jià)值微藻產(chǎn)品生產(chǎn)上的應(yīng)用, 以期基因工程技術(shù)在提高微藻產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力中發(fā)揮重要的作用。

1 微藻的基因工程

單細(xì)胞微藻在學(xué)術(shù)研究和工業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì), 其原因主要有三點(diǎn): 1) 微藻以光合固碳為主的生活方式; 2) 細(xì)胞內(nèi)可合成多種高價(jià)值的天然產(chǎn)物; 3) 對(duì)高通量技術(shù)的適應(yīng)性[4]。微藻的基因工程從一個(gè)基因開(kāi)始, 操作或?qū)朐摶蚓蜁?huì)獲得所需要的表型[5], 這種技術(shù)可以改善藻類的代謝, 并通過(guò)引入外源基因以獲得所需要的高價(jià)值化合物, 如重組蛋白質(zhì)、色素以及其他代謝產(chǎn)物[6]。將基因元件(啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、開(kāi)放閱讀框、終止子等)有機(jī)地連接起來(lái), 便形成了功能基因模塊[7], 把功能基因模塊導(dǎo)入已有生物網(wǎng)絡(luò), 異源表達(dá)出底盤細(xì)胞不能合成的產(chǎn)物或?qū)σ延械漠a(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化, 在藥物、能源、食品等方面已有突出進(jìn)展。

1.1 原核微藻的基因工程

原核微藻是地球上最古老的一類生物之一, 主要以藍(lán)藻(也被稱為藍(lán)細(xì)菌)為主, 螺旋藻、集胞藻等都屬于原核微藻。相對(duì)于真核微藻, 原核微藻更容易獲得高的生物量積累, 這是建立生產(chǎn)高價(jià)值化合物細(xì)胞工廠的有利條件。目前, 在一些藍(lán)藻中已經(jīng)建立了成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系, 包括合適的外源基因插入位點(diǎn)、基因表達(dá)調(diào)控元件、篩選標(biāo)記基因以及轉(zhuǎn)化方法等。

螺旋藻具有很高的蛋白質(zhì)含量, 且適合規(guī)模化養(yǎng)殖。目前, 我國(guó)的螺旋藻生物量產(chǎn)量能夠達(dá)到10 000 t/a(細(xì)胞干重)。但是, 螺旋藻細(xì)胞內(nèi)較高的核酸酶活性抑制了外源基因的整合, 使螺旋藻遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建變得極為困難。集胞藻擁有一套天然的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)且遺傳背景清晰, 在集胞藻中可以通過(guò)同源重組的方法將外源基因整合到染色體上, 是目前基因工程研究最常用的藻株之一[8]。

1.2 真核微藻的基因工程

由外源基因編碼的蛋白質(zhì)通常在細(xì)胞核或葉綠體中表達(dá), 建立高效的轉(zhuǎn)化體系有利于提高微藻潛在的應(yīng)用價(jià)值, 因此許多科學(xué)家和公司正向這樣的方向發(fā)展。在對(duì)微藻進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí), 應(yīng)考慮兩個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的特性, 選擇合適的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)達(dá)到自己的目的。目前, 萊茵衣藻()是最先進(jìn)的微藻平臺(tái), 其有兩套成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng): 核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)及葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng), 并在科學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用[9]。外源基因表達(dá)的難題促進(jìn)了微藻基因工程領(lǐng)域的研究, 加快了啟動(dòng)子及篩選標(biāo)記在轉(zhuǎn)基因微藻中的應(yīng)用速度。但是, 目前已成功實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)化的微藻種類仍然有限。對(duì)于新的藻種的轉(zhuǎn)化, 特別是具有重要商業(yè)價(jià)值的微藻, 將有更多的工作有待進(jìn)一步開(kāi)展。

1.2.1 核轉(zhuǎn)化

微藻的遺傳操作需要穩(wěn)定的核轉(zhuǎn)化, 并且能夠高效地表達(dá)重組蛋白質(zhì)或關(guān)鍵酶以提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量。但是外源DNA核表達(dá)的低效一直是難以解決的問(wèn)題, 目前, 已經(jīng)提出位置效應(yīng)、RNA沉默、過(guò)度緊湊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和非常規(guī)的表觀遺傳效應(yīng)作為杜氏藻中外源蛋白核表達(dá)低效的可能原因[10]。此外, 也有報(bào)道稱低表達(dá)水平可能是由于外源DNA的隨機(jī)整合[11], 這種現(xiàn)象也被認(rèn)為是外源DNA的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)元件對(duì)宿主基因組中整合位點(diǎn)產(chǎn)生的影響[10], 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)促進(jìn)這一問(wèn)題的解決。

1.2.2 葉綠體轉(zhuǎn)化

葉綠體轉(zhuǎn)化利用 DNA 同源重組機(jī)制, 在外源基因兩個(gè)側(cè)翼加入底盤細(xì)胞葉綠體基因組中兩段相鄰的同源序列, 從而較精確地控制外源基因插入葉綠體基因組中的功能基因之間, 避免產(chǎn)生位置效應(yīng)。并且該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)不需要翻譯后修飾[12], 可以成功地在葉綠體基因組中獲得外源蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率。

要進(jìn)行微藻葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化, 必須選擇合適的基因插入位點(diǎn), 外源基因的插入應(yīng)當(dāng)不影響微藻的正常生存。目前, 已有許多微藻的葉綠體基因組完成測(cè)序, 為外源基因在葉綠體的精確定位奠定了基礎(chǔ)。然而, 藻類葉綠體作為一個(gè)新興的轉(zhuǎn)基因平臺(tái), 其進(jìn)展大部分都集中在重組蛋白質(zhì)的研究上, 對(duì)其他高價(jià)值化合物的研究較少, 取得的進(jìn)展也不多。

2 基因工程的應(yīng)用: 微藻細(xì)胞工廠的產(chǎn)品

2.1 生物燃料

微藻因高碳水化合物、高脂質(zhì)含量、生長(zhǎng)速度快、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì), 已經(jīng)成為生物燃料生產(chǎn)的替代原料之一[1, 13]。對(duì)能源需求的不斷增加和生物燃料生產(chǎn)路線不斷進(jìn)步增加了微藻作為第3代生物燃料潛力的研究[14]。但是, 微藻生物燃料的商業(yè)化由于經(jīng)濟(jì)特性差而受到阻礙, 基因工程技術(shù)在生物燃料生產(chǎn)中顯示出了很有前景的結(jié)果, 是目前克服這一挑戰(zhàn)最有希望的策略之一[15]。

2.1.1 生物柴油

在同樣的條件下, 微藻的光合生產(chǎn)率要比高等植物高數(shù)十倍, 這也使一些微藻細(xì)胞中的脂肪酸合成反應(yīng)異?；钴S, 能夠在細(xì)胞中形成高達(dá)70%的油脂含量[16]。單細(xì)胞的微藻不僅具有較高的生物量生產(chǎn)力和快速積累油脂的能力, 還能夠解決傳統(tǒng)油料作物與糧食作物關(guān)于土地競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題, 使其成為大規(guī)模生產(chǎn)生物柴油的資源[17-19]。通過(guò)基因工程和代謝工程改善微藻的脂質(zhì)含量是生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力的微藻生物燃料的先決條件[20], 許多研究已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了微藻中脂質(zhì)的過(guò)量生產(chǎn)[21]。

脂肪酸的生物合成途徑是以丙酮酸合成的乙酰輔酶A為底物, 經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的催化后進(jìn)入脂肪酸合成途徑。因此, Li等[20]在三角褐指藻()葉綠體中過(guò)表達(dá)了ACCase, 從而使細(xì)胞中的脂質(zhì)過(guò)量生產(chǎn), 這種方法為工業(yè)上利用微藻生物反應(yīng)器生產(chǎn)高價(jià)值化合物提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。然而, 之前有研究報(bào)道了乙酰輔酶A羧化酶基因在硅藻(和)的表達(dá)導(dǎo)致了ACCase活性的增加, 但沒(méi)有顯著的脂質(zhì)增加[22], 這可能是由于靶基因的隨機(jī)整合和ACCase在胞漿而非葉綠體中的非特異性表達(dá)以及ACCase的抑制作用所致[11]?；蚓庉婥RISPR/Cas9技術(shù)在微藻能源領(lǐng)域的應(yīng)用也取得了令人鼓舞的成果, 有研究者應(yīng)用 CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)微擬球藻()的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(ZnCys)作了基因敲除和部分沉默, 使突變株的脂質(zhì)產(chǎn)率比野生型提高了一倍, 其原因在于 ZnCys 的敲除導(dǎo)致了部分蛋白合成受阻, 而相應(yīng)的碳源轉(zhuǎn)而用于脂類合成[19]。

脂肪酸合成酶(FAS)的核心?；d體蛋白(ACP)與硫酯酶(TE)的相互作用調(diào)控著脂肪酸的釋放, 這決定了脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和性質(zhì)[23]。Blatti等[23]以萊茵衣藻為模型, 證明了ACP和TE之間相互作用控制藻類葉綠體內(nèi)脂肪酸的水解機(jī)制。表征藻類FAS的結(jié)構(gòu)域及不同蛋白質(zhì)之間的相互作用將會(huì)對(duì)優(yōu)化微藻中脂肪酸生物合成酶的異源表達(dá)發(fā)揮重要的作用, 從而顯著改變轉(zhuǎn)基因藻株的脂肪酸譜。事實(shí)上, 短鏈脂肪酸更適于生物柴油的生產(chǎn), 因?yàn)檩^高的短鏈脂肪酸含量能夠改善生物柴油的冷流特性[24], 因此, Liu 等[25]將對(duì)短鏈脂肪酸特異的?；?ACP硫酯酶基因轉(zhuǎn)入野生型集胞藻(sp. PCC 6803)中,顯著提高了藻細(xì)胞短鏈脂肪酸含量。

目前, 藻類學(xué)家正致力于在微藻細(xì)胞中過(guò)表達(dá)脂肪酸合成相關(guān)基因, 以及下調(diào)脂肪酸β-氧化和脂肪酶水解相關(guān)基因的研究[16]。這些研究將有助于提高細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量, 以在不久的將來(lái)更加經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)藻類生物柴油。

2.1.2 生物乙醇

近年來(lái)報(bào)道了很多用于生產(chǎn)生物乙醇的藻類, 比如紫球藻()、四肩突四鞭藻()、鏈帶藻(sp.)以及工程藍(lán)藻。其中, 利用工程藍(lán)藻(如sp. PCC 6803和sp. PCC 7992)直接生產(chǎn)乙醇的方法已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展, 在大腸桿菌和釀酒酵母中生產(chǎn)生物乙醇的研究促進(jìn)了這一進(jìn)程[14]。

微藻細(xì)胞內(nèi)通過(guò)光合作用積累的碳水化合物有利于生物乙醇的產(chǎn)生, 然而,“光發(fā)酵”在自然界是行不通的, 需要通過(guò)基因工程方法對(duì)微藻原有的生物化學(xué)途徑進(jìn)行遺傳改造, 從而有效地生產(chǎn)生物乙醇。Dexter等[8]利用同源重組系統(tǒng)將來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌()的丙酮酸脫羧酶(PDC)和乙醇脫氫酶(ADH Ⅱ)基因整合到集胞藻PCC 6803染色體中, 促進(jìn)了生物乙醇的生產(chǎn)。為了提高光合藍(lán)藻系統(tǒng)中的乙醇產(chǎn)量, 需要解決的一個(gè)問(wèn)題是藍(lán)藻細(xì)胞的低乙醇耐受性。Song等[26]在集胞藻PCC 6803中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與乙醇耐受性直接相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子, 該基因可以作為基因工程的有價(jià)值靶標(biāo), 以進(jìn)一步改善集胞藻對(duì)乙醇的耐受性。此外, Yoshikawa等[27]通過(guò)代謝工程研究發(fā)現(xiàn)煙酰胺輔酶[NAD(P)H]脫氫酶基因的敲除顯著提高了乙醇產(chǎn)量, 敲除該基因的藻株較對(duì)照藻株提高了145%。研究微藻生物乙醇的關(guān)鍵是要提高微藻生產(chǎn)乙醇的能力, 在經(jīng)濟(jì)上減小化石能源的優(yōu)勢(shì), 使微藻生物乙醇成為可行的選擇。

2.1.3 生物氫

不同于生物柴油和生物乙醇, 氫氣的燃燒僅產(chǎn)生水(H2O), 不會(huì)產(chǎn)生污染物質(zhì)和二氧化碳(CO2), 能夠緩解全球變暖和污染問(wèn)題[28]。微藻在陽(yáng)光下通過(guò)葉綠體氫化酶(HydA1和HydA2)催化從H2O中提取質(zhì)子(H+)和電子(e–)并將其利用直接制氫[29]。有報(bào)道表明氧氣(O2)的存在會(huì)不可逆地抑制葉綠體氫化酶的活性[30-32], 并且也對(duì)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)成熟也有抑制作用[33]。

目前已經(jīng)確定了產(chǎn)生耐O2氫化酶的策略, 即一方面改造耐受O2的藻類內(nèi)源性氫化酶[34], 另一方面可以在微藻中異源表達(dá)O2耐受性氫化酶[35]。定點(diǎn)突變可用于內(nèi)源性氫化酶的修飾[36], 隨機(jī)和定點(diǎn)突變都有助于獲得具有高O2耐受性氫化酶的微藻突變株[37]。Xu等[35]將桃紅莢硫菌 ()的O2耐受性氫化酶基因和轉(zhuǎn)入集胞藻PCC 7942中, 得到了一種重組藍(lán)藻產(chǎn)氫系統(tǒng)。然而, 能夠轉(zhuǎn)入微藻的O2耐受性氫化酶基因太少。于是, Xu等[38]在萊茵衣藻中引入了一條消耗O2新的途徑, 即將大腸桿菌的丙酮酸氧化酶(PoX, 消耗O2催化丙酮酸脫羧成乙酰磷酸和CO2)轉(zhuǎn)入衣藻, 在不影響生長(zhǎng)的情況下將H2的產(chǎn)量增加到野生型的2倍。另外, 在微藻葉綠體中引入O2的螯合劑也可以有效地清除細(xì)胞中的O2。固氮根瘤菌() 中的豆血紅蛋白(leghemoglobins, LbA)可以螯合并運(yùn)輸O2, 且已經(jīng)證明(豆血紅蛋白基因)的表達(dá)可以提高H2的產(chǎn)率[39], 因此, 將(亞鐵螯合酶)基因和基因整合到衣藻葉綠體中獲得了高表達(dá)的HemH-LbA蛋白, 從而通過(guò)增強(qiáng)呼吸速率提高了藻類H2產(chǎn)量[40]。了解H2生產(chǎn)途徑的分子基礎(chǔ)以及基因工程技術(shù)的應(yīng)用可以增強(qiáng)微藻生物氫的產(chǎn)生, 以促進(jìn)微藻生物氫的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 醫(yī)藥與保健功能食品

商業(yè)上用于食品和膳食補(bǔ)充劑生產(chǎn)的微藻在國(guó)際上被認(rèn)為是安全的[2], 因此, 微藻及微藻產(chǎn)品在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用正逐步受到人們的重視。近年來(lái), 一些重組治療蛋白質(zhì)已經(jīng)在微藻中成功表達(dá), 微藻中一些重要藥用成分的應(yīng)用也被廣泛研究。

2.2.1 重組治療蛋白質(zhì)

重組蛋白質(zhì)通常在藻類葉綠體基因組中表達(dá)。在藻類葉綠體中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)之所以特別有吸引力, 是因?yàn)樵摷?xì)胞器含有適于使用合成生物學(xué)方法進(jìn)行遺傳操作的最小基因組, 并且轉(zhuǎn)基因可以精確定位于特定的基因組位點(diǎn), 適合重組蛋白質(zhì)高水平、可調(diào)節(jié)和穩(wěn)定的表達(dá)[41]。近幾年, 重組治療性蛋白質(zhì)在微藻葉綠體表達(dá)的技術(shù)已經(jīng)日趨成熟。研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到生物技術(shù)的應(yīng)用和微藻葉綠體作為蛋白質(zhì)工廠的開(kāi)發(fā)上, 并通過(guò)在質(zhì)體中添加新的基因來(lái)制造有價(jià)值的重組產(chǎn)品, 比如單克隆抗體、免疫毒素等蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

到目前為止, 單克隆抗體的生產(chǎn)成本一直是非常昂貴的。利用基因工程技術(shù)在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)單克隆抗體不僅能夠降低成本, 還可以最大程度降低抗體的鼠源性, 從而降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)。Hempel等[42]在三角褐指藻中引入外源基因以產(chǎn)生針對(duì)馬爾堡病毒()核蛋白的單克隆IgG抗體, 并經(jīng)過(guò)多種測(cè)試證實(shí)了抗體的安全性和耐受性; 另外, 有研究者利用細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和表面等離子體共振對(duì)三角褐指藻產(chǎn)生的抗乙型肝炎重組IgG分別與兩個(gè)人類Fcγ受體(FcγRI 和FcγRIIIa)的結(jié)合能力進(jìn)行了表征, 結(jié)果表明藻源性抗體可與FcγRI和FcyRIIIa結(jié)合, 并且其與FcyRIIIa的親和力是正常人IgG1的3倍[43]; 這些研究突出了微藻作為單克隆抗體的穩(wěn)定和低成本表達(dá)平臺(tái)的潛力。此外, 微藻還是生產(chǎn)免疫毒素的極具吸引力的宿主, Tran等[44]設(shè)計(jì)了一種由B細(xì)胞表面分子CD22的單鏈抗體(scFv)與銅綠假單胞菌()外毒素A(PE40)的結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ融合而成免疫毒素基因, 經(jīng)過(guò)修飾的毒素?zé)o法與細(xì)胞結(jié)合, 產(chǎn)生的免疫毒素的毒性比天然外毒素A低100倍, 因此更加安全。目前, 藻類學(xué)家們正致力于重組蛋白質(zhì)遺傳工具和生產(chǎn)條件的優(yōu)化[45-49], 以提高微藻葉綠體外源蛋白表達(dá)的產(chǎn)量。

選擇一個(gè)高活性的啟動(dòng)子是實(shí)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)高效表達(dá)的關(guān)鍵, 因此許多研究集中在通過(guò)研究啟動(dòng)子的效率來(lái)提高微藻中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量[10, 50]。對(duì)于微藻中的外源基因表達(dá), 已開(kāi)發(fā)出多種不同的啟動(dòng)子, 但大多數(shù)是組成型啟動(dòng)子或內(nèi)源性誘導(dǎo)啟動(dòng)子, 它們的應(yīng)用僅限于目標(biāo)宿主和產(chǎn)品, 且調(diào)控能力有限。因此, Lee等[50]在萊茵衣藻中成功開(kāi)發(fā)出了一種由調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)AlcR和控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子(P)組成的可用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的外源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AlcR-P系統(tǒng), 使靶基因的表達(dá)響應(yīng)乙醇的誘導(dǎo)。盡管重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平較低, 但這個(gè)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)對(duì)于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)具有重要的意義。

傳統(tǒng)蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)成本昂貴且對(duì)技術(shù)要求苛刻, 需要精密的發(fā)酵設(shè)備, 昂貴的下游加工、冷藏和運(yùn)輸成本以及無(wú)菌輸送方法[41]。相比之下, 微藻重組治療蛋白質(zhì)的生產(chǎn)更加經(jīng)濟(jì)可持續(xù)。目前, 在微藻中生產(chǎn)的生物藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于商業(yè)生產(chǎn), 并且少數(shù)藥物已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試[51]。然而, 在微藻基因工程藥物完全取代傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的生物藥物之前, 還需要大量的基礎(chǔ)研究對(duì)微藻生物藥物的安全性進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.2 保健功能食品

微藻可作為功能性產(chǎn)品的來(lái)源。研究表明, 微藻及微藻產(chǎn)品有增加人體免疫力、抗腫瘤和對(duì)心血管系統(tǒng)保健的作用, 對(duì)一些疾病有預(yù)防和治療作用。微藻作為食品的開(kāi)發(fā)已有幾十年的歷史, 隨著對(duì)微藻營(yíng)養(yǎng)作用的不斷闡明, 人們?cè)絹?lái)越重視微藻保健功能食品的開(kāi)發(fā)與利用。以類胡蘿卜素為例, 微藻來(lái)源的天然β-胡蘿卜素比人工合成的更容易被人體吸收, 在醫(yī)藥行業(yè)中更令人關(guān)注。為了提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量, Chen等[52]合成了編碼297個(gè)氨基酸的基因(891 bp), 并在柵藻(sp. CPC2)中表達(dá), 使重組藻株β-胡蘿卜素含量提高了3倍; 酮類胡蘿卜素(ketocarotenoids)作為膳食補(bǔ)充劑需求量是很大的, 但是大多數(shù)藻類和高等植物沒(méi)有胡蘿卜素酮酶活性, 不合成酮類胡蘿卜素。因此, 將來(lái)源于雨生紅球藻()的一些基因轉(zhuǎn)入其他藻株(如衣藻、鹽藻)中表達(dá)以合成酮類胡蘿卜素是未來(lái)工廠化的一種很有前景的方法[53]。編碼β-胡蘿卜素酮酶和β-胡蘿卜素羥化酶的和基因, 是雨生紅球藻蝦青素合成所必需的關(guān)鍵酶基因, Zheng等[54]將含有和基因的兩種載體共轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻中, 獲得了比野生型多累積34%的蝦青素。這表明外源和基因在藻細(xì)胞中成功表達(dá), 并負(fù)責(zé)催化轉(zhuǎn)基因藻類中蝦青素的生物合成。Anila等[55]也通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法驗(yàn)證了杜氏鹽藻生產(chǎn)蝦青素的可行性。然而, 在具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的藻株中表達(dá)蝦青素的研究處于起步階段, 存在的問(wèn)題依舊是產(chǎn)量低下, 還需要不斷地優(yōu)化以提高產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)室在集胞藻PCC 6803中構(gòu)建了便于表達(dá)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系, 在此基礎(chǔ)上, 轉(zhuǎn)化了來(lái)源于雨生紅球藻的和基因并檢測(cè)到較高的蝦青素產(chǎn)率, 但是還需要進(jìn)一步優(yōu)化以提高微藻積累蝦青素的能力[56]。

2.3 動(dòng)物飼料和飼料添加劑

微藻是昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)、幼魚(yú)及貝類的天然餌料。因此, 藻類學(xué)家提出了把經(jīng)過(guò)基因改造的衣藻和眼點(diǎn)微擬球藻()用于向有害昆蟲(chóng)(如蚊子幼蟲(chóng))經(jīng)口傳遞毒素或?qū)⒁呙绾蜕L(zhǎng)激素遞送到養(yǎng)殖的魚(yú)類和貝類體內(nèi)[57-59]。這不僅可以提高養(yǎng)殖魚(yú)類和貝類幼體的成活率, 還避免了對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的病原體與廢水一起傳播, 從而造成嚴(yán)重的環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)。同樣地, 一些工業(yè)化微藻的安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也為家禽和家畜提供了“功能化飼料”的可能性, 例如, 在衣藻中表達(dá)的植酸酶(磷酸六肌醇酶)提高了家禽和家畜對(duì)植酸的利用效率并減少了植酸的排泄[60-61], 這證明了在不需要蛋白質(zhì)純化的情況下可以直接利用轉(zhuǎn)基因微藻作為食品添加劑提供膳食酶。目前, 本實(shí)驗(yàn)室正在建立等鞭金藻()轉(zhuǎn)基因體系, 在金藻中表達(dá)抗菌肽, 提高金藻的餌料價(jià)值, 為水產(chǎn)養(yǎng)殖開(kāi)辟新途徑[62]。

3 微藻基因工程的瓶頸與展望

盡管藻類是生產(chǎn)各種高價(jià)值化合物的最有前景的資源, 但其大規(guī)模應(yīng)用還存在一些環(huán)境和經(jīng)濟(jì)上的瓶頸。例如, 目前僅有少數(shù)微藻產(chǎn)品能夠以生態(tài)友好和經(jīng)濟(jì)可行的方式進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn), 而使用微藻作為化石燃料替代原料的所有實(shí)踐都是不成功的。到目前為止, 還沒(méi)有任何工業(yè)規(guī)模的設(shè)施能夠同時(shí)滿足環(huán)境友好和經(jīng)濟(jì)可行而進(jìn)行大規(guī)模藻類生物燃料的生產(chǎn)。有研究者已經(jīng)提出從微藻中提取高價(jià)值的副產(chǎn)品以提高基于微藻的生物燃料的經(jīng)濟(jì)性[1]; 也可以從篩選優(yōu)勢(shì)藻株出發(fā), 開(kāi)發(fā)穩(wěn)定高產(chǎn)的藻株以維持低成本的規(guī)模化養(yǎng)殖并改進(jìn)上下游工藝、完善發(fā)酵工藝, 從而提高經(jīng)濟(jì)效益。除此之外, 還必須寄希望于微藻領(lǐng)域的初創(chuàng)企業(yè)對(duì)微藻生物燃料以及其他高價(jià)值產(chǎn)物的突破, 這可能需要更多的研究和開(kāi)發(fā)資金支持并通過(guò)公共補(bǔ)貼與較低成本的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)形成競(jìng)爭(zhēng)。

高效率且穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍是制約微藻基因工程的瓶頸問(wèn)題, 需要通過(guò)嘗試不同的轉(zhuǎn)化方法、優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件、篩選合適的表達(dá)載體和啟動(dòng)子來(lái)提高轉(zhuǎn)化效率。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步, 更多藻株的基因組將會(huì)被解碼, 許多未知功能的基因也會(huì)被注釋, 這會(huì)促進(jìn)科學(xué)家們對(duì)藻類的研究以及微藻基因工程的發(fā)展。值得一提的是, 基因編輯CRISPR/Cas9技術(shù)在微藻研究領(lǐng)域的應(yīng)用也取得了令人鼓舞的成果, 研究者已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶基因的精確敲除或敲低[63-66]。有理由相信, CRISPR/Cas9 技術(shù)將幫助人們以更快的速度來(lái)對(duì)目的基因進(jìn)行編輯, 不僅僅是理解它們的功能, 更重要的是對(duì)目標(biāo)基因的改造?？偠灾? 在微藻的合成生物學(xué)未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展之前, 基因工程仍然是改造微藻的最有效手段。

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Application of microalgae genetic engineering in the production of high-value compounds

WANG Kang1, 2, CUI Yu-lin1, 3, GAO Zheng-quan4, MENG Chun-xiao4, QIN Song1, 3

(1. Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

Microalgae has the potential to be a cell factory in the production of proteins, oils, and pigments and is crucial in solving problems of traditional biomass production and future market. Genetic engineering promotes the improvement and industrialization of microalgae. In this paper, the research progress of microalgae genetic engineering and genetic engineering application in the microalgae production of biofuels and medicines are reviewed. This article can provide some ideas for the research and application of genetic engineering technology in microalgae, thereby facilitating microalgae and microalgae products to become more economically competitive.

microalgae; cell factory; high-value compounds; genetic engineering

Nov. 22, 2019

Q-3

A

1000-3096(2021)12-0142-08

10.11759/hykx20191122003

2019-11-22;

2020-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(31972815)

[National Natural Science Foundation of China, No. 31972815]

王康(1995—), 男, 山東濟(jì)寧人, 博士研究生, 主要從事微藻代謝工程和分子遺傳學(xué)的研究, 電話: 13258052731, E-mail: wangkangsdut@126.com; 孟春曉(1976—),通信作者, 女, 山東淄博人, 教授, 主要從事微藻生理學(xué)和微藻分子遺傳學(xué)的研究, E-mail: mengchunxiao@126.com; 秦松(1968—), 通信作者, 男, 山東掖縣人, 研究員, 主要從事分子藻類學(xué)研究, E-mail: sqin@yic.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)