李詩婷，郭玲通訊作者，龔琴琴，蔣澤梅，甘建妮，李俊霞，張永萍，徐劍

(貴州中醫(yī)藥大學藥學院制劑實驗室，貴州 貴陽)

0 引言

子宮內(nèi)膜癌是原發(fā)于子宮內(nèi)膜上皮的女性生殖器官惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率近來年均有上升趨勢[1]。雖然目前針對子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療手段不斷發(fā)展，但其總體療效不佳，病人承受很大痛苦。研究開發(fā)療效更加顯著的腫瘤治療方法仍是醫(yī)藥工作者亟需解決的醫(yī)學難題之一。雷公藤紅素，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤、南蛇藤植物中提取的五環(huán)三萜類單體化合物[2]，是雷公藤及其制劑包括雷公藤片、雷公藤多苷片的主要有效活性成分之一。其作為一種天然蛋白酶抑制劑[3]，能有效抑制蛋白酶體活性和誘導細胞凋亡，對前列腺癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]、白血病[7]、膠質瘤[8]、結腸癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11,12]等多種腫瘤細胞均產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤活性。然而，目前尚未見雷公藤紅素用于治療子宮內(nèi)膜癌的研究報道。本文擬選擇人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細胞為研究對象，考察雷公藤紅素對人子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、周期及凋亡的影響，為將其開發(fā)為子宮內(nèi)膜癌治療藥物提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Olympus BX5 型生物顯微鏡( 日 本Olympus 公 司)；MCO-17AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo 公司)；YDS-35-125 型液氮罐( 成都液氮容器廠)；BD-100LT 型低溫冷凍柜(青島海爾電冰柜有限公司)；SW-TJ 型水平流凈化工作臺(蘇州市凈化設備總廠)；AQZX-C 型空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；Allegra X-22R 型高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter 公司)；Varioskan Flash 型酶標儀( 美國Thermo Fisher Scientific 公 司)；CytomicsFC500 型 流 式 細 胞儀(美國 Beckman Coulter 公司)。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素( 成都普菲德生物科技有限公司，批號：18032109，純度：＞98.0%)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、核糖核酸酶A(RNAse A)溶液、碘化丙啶(PI)、0.25%胰酶(北京索萊寶科技有限公司)；AnnexinV-FITC/PI 雙染試劑盒(美國BD 公司)；1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗(廣州吉尼歐生物科技有限公司)；胎牛血清(美國 GIBCO 公司)。

1.3 細胞株

人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細胞株購自廣州吉尼歐生物科技有限公司，由本實驗室保種。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HHUA 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的1640 培養(yǎng)液中，于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化細胞進行傳代，每周約3 次，隔天更換一次培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞增殖實驗

采用MTT 法檢測雷公藤紅素對HHUA 細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的HHUA 細胞，計數(shù)后按每孔5 000 個細胞接種于96 孔板中，待細胞貼壁長至80%匯合度時，小心棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度(0.1、0.4、1.4、6.4、25.6 μg/mL)的雷公藤紅素培養(yǎng)基溶液進行干預，每孔200 μL，同時設置空白組(無細胞)和對照組，每組設5 個復孔。培養(yǎng)36 h 后，棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 含0.5 mg/ mL MTT 的PBS 溶液，繼續(xù)孵育4 h。中止培養(yǎng)，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，將培養(yǎng)板置于37℃±0.5 ℃空氣浴振蕩器中振搖15 min，使結晶物甲瓚充分溶解。于酶標儀上570 nm 處測定各孔的吸光值A，記錄結果。按以下公式計算細胞存活率：

細胞存活率(%)=[(A 加藥組-A 空白組)/(A 對照組-A 空白組)]×100%

2.3 細胞周期實驗

利用PI 染色法檢測雷公藤紅素對HHUA 細胞周期分布的影響。取對數(shù)生長期的HHUA 細胞，計數(shù)后按每孔300 000 個細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁并長至80%匯合度時，棄去培養(yǎng)基，以1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素處理細胞，同時用培養(yǎng)液作為空白對照組，每組設3 個復孔。培養(yǎng)36 h 后，用胰蛋白酶消化細胞，提取l mL 細胞懸液，于4 °C，2 000 rpm離心5 min，去除上清液后用預冷的75 %乙醇于4 °C 固定30 min，離心去除上清液，用PBS 洗滌，加0.3 mL PBS 重懸后加入0.l mL 0.1%Triton X-100 溶液室溫下孵育15 min 進行打孔。孵育后再加入0.1 mL 0.1 mg/mL 的RNaseA 酶，37 °C孵育30 min 降解RNA，然后加入0.2 mL 0.1 mg/mL 的PI 染色DNA，4 °C 孵育30 min 后用流式細胞儀測定各組細胞周期分布情況，并用 ModFit LT 2.0 軟件進行分析。

2.4 細胞凋亡實驗

采用AnnexinV-FITC/PI 雙染法定量評價細胞凋亡情況。取對數(shù)生長期的細胞，計數(shù)后按每孔300 000 個細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁并長至80% 匯合度時，棄去培養(yǎng)基，加入含雷公藤紅素1.07 4 μg/mL 的培養(yǎng)基溶液，同時用培養(yǎng)液作為空白對照組，每組設3 個復孔。加藥培養(yǎng)36 h 后，按Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒標準操作步驟進行染色，染色后樣品于1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測分析。

3 統(tǒng)計學分析

采用Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以均值±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析、t檢驗，*P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 雷公藤紅素對HHUA 細胞增殖的影響

MTT 結果如圖1 所示，雷公藤紅素對人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細胞的增殖呈現(xiàn)抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性。雷公藤紅素處理HHUA 細胞36 h 后，細胞存活率的IC50 值為1.07 4 μg/mL，后續(xù)實驗均在該濃度下進行。

圖1 雷公藤紅素對HHUA 細胞增殖的影響。(A)不同濃度雷公藤紅素處理HHUA 細胞36 h 后，MTT 法測得的細胞存活率結果。(B)雷公藤紅素干預HHUA 細胞36 h 的IC50 值。

4.2 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響

如圖2 和表1 所示，雷公藤紅素作用HHUA 細胞36 h后，與0 μg/mL雷公藤紅素組比較，1.07 4 μg/mL雷公藤紅素組G0/G1 期細胞比例顯著增加，S 期細胞比例顯著減少(P＜0.05)。此外，當用雷公藤紅素處理后，藥物組不僅將細胞阻滯在G0/G1 期，同時還使得Sub G1 期細胞比例增加。

圖2 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響

4.3 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響

如圖3 和表2 所示，雷公藤紅素可顯著增加細胞早期凋亡和晚期凋亡率。與對照組比較，1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素處理HHUA 細胞36 h 后，細胞凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。

圖3 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響

表1 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響 (%，±s，n=3)

表1 雷公藤紅素對HHUA 細胞周期的影響 (%，±s，n=3)

注：與0 μg/mL 雷公藤紅素組比較，*P＜0.05。

組別 Sub G1 期 G0/G1 期 S 期 G2/M 期0 μg/mL 1.47±0.05 51.63±2.02 31.61±1.63 16.76±1.08 1.07 4 μg/mL 19.51±0.85* 62.73±1.27* 23.11±0.84* 14.16±0.78

表2 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響 (%，±s，n=3)

表2 雷公藤紅素對HHUA 細胞凋亡的影響 (%，±s，n=3)

注：與0 μg/mL 雷公藤紅素組比較，*P＜0.05。

組別 早凋亡 晚凋亡 總凋亡0 μg/mL 7.4±0.9 2.3±1.0 9.8±2.0 1.07 4 μg/mL 25.2±1.4* 12.7±1.5* 37.9±1.0*

5 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20 %-30 %[13]。雷公藤紅素是中藥雷公藤的主要有效活性成分之一，經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，其不僅在抗炎、免疫抑制、抗神經(jīng)退行性疾病等[14]領域顯示了良好的藥理活性，還在治療腫瘤等方面展示了其潛力，極具開發(fā)價值。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對體外培養(yǎng)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤細胞包括宮頸癌細胞[15]和卵巢癌細胞[16]均有較強的抑制作用，并能誘導細胞凋亡。但雷公藤紅素對于子宮內(nèi)膜癌的抗腫瘤作用至今尚未見報道。本實驗研究雷公藤紅素對子宮內(nèi)膜癌細胞株HHUA 細胞的作用，探究臨床應用雷公藤紅素治療子宮內(nèi)膜癌的可行性。

本實驗通過MTT 法觀察了不同濃度的雷公藤紅素(0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 μg/mL)對人子宮內(nèi)膜癌細胞株HHUA 的生長抑制情況，并與空白對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對HHUA 細胞的增殖呈現(xiàn)抑制作用，且具有明顯的濃度依賴性，在一定的濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，抑制作用也顯著增加。

癌細胞的細胞周期處于失控狀態(tài)，這是癌細胞可以無限增殖的原因之一，抗腫瘤藥物可通過阻滯細胞周期抑制腫瘤生長[17]。雷公藤紅素可將HHUA 細胞周期相對阻滯在G0/G1 期，使G0/G1 期細胞比例顯著增加，S 期細胞比例顯著減少。此外雷公藤紅素還使Sub G1 期細胞顯著增多，Sub G1期代表亞二倍體DNA 的含量，象征著細胞凋亡，說明雷公藤紅素不僅產(chǎn)生了細胞周期阻滯作用，還誘導了子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生凋亡。因此，本課題進一步采用AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測細胞凋亡情況。實驗結果表明，與對照組比較，1.07 4 μg/mL 雷公藤紅素干預HHUA 細胞36 h 后，HHUA 細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。

綜上所述，本研究首次探索了雷公藤紅素對人子宮內(nèi)膜癌HHUA 細胞的抗腫瘤作用，結果發(fā)現(xiàn)其體外抗腫瘤作用明顯，雷公藤紅素可能通過干擾細胞周期，誘導細胞凋亡進而抑制HHUA 細胞的增殖生長。后期筆者將建立動物模型，結合體內(nèi)、體外實驗進一步深入探索雷公藤紅素對子宮內(nèi)膜癌的治療作用，并探究雷公藤紅素阻滯細胞周期以及誘導細胞凋亡的分子機制，為其臨床應用奠定一定實驗基礎。