謝恩耀，金 琎

（1.康師傅控股中央研究所，上海 201403；2.蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

鐵皮石斛具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、利濕消腫、緩解神經(jīng)衰弱等作用，主要產(chǎn)于我國(guó)的江浙地區(qū)，生長(zhǎng)條件較為苛刻，發(fā)育過(guò)程遲緩，組織培養(yǎng)技術(shù)是解決其資源問(wèn)題最有效的途徑[1]。近年來(lái)，張啟香等對(duì)石斛類原球莖進(jìn)行液體培養(yǎng)的研究，并建立完善了石斛的液體培養(yǎng)技術(shù)[2]。

鐵皮石斛種子、原球莖、幼苗莖段均可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)[3]。目前較為成熟的技術(shù)體系為：外植體→原球莖→愈傷組織→叢芽→苗子[4]。培養(yǎng)基是組培過(guò)程中植株生長(zhǎng)發(fā)育營(yíng)養(yǎng)的來(lái)源，是組培成敗的關(guān)鍵因素。本研究選取性狀優(yōu)良的鐵皮石斛作為試驗(yàn)組培外植體材料，進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)試驗(yàn)，對(duì)鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)基的生長(zhǎng)因素進(jìn)行分析篩選，并對(duì)其組培增殖體系進(jìn)行系統(tǒng)地論證及優(yōu)化，為鐵皮石斛的資源化發(fā)展及快繁技術(shù)提供有效的技術(shù)支撐及保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、培養(yǎng)基及激素

試驗(yàn)過(guò)程中的組培苗選自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育苗基地，采用鐵皮石斛種子進(jìn)行萌發(fā)并選育出表現(xiàn)形狀較為良好的幼苗。試驗(yàn)過(guò)程中的相關(guān)試劑均依據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行相關(guān)母液及激素的配置[11]，試驗(yàn)所用的試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 培育條件

光照時(shí)長(zhǎng)控制在12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～1 200 lx，培養(yǎng)過(guò)程中的環(huán)境溫度為25±1℃，培養(yǎng)基均分裝好后進(jìn)行滅菌處理以減少分裝過(guò)程中的污染，滅菌前培養(yǎng)基pH=5.8[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

根、莖、芽均取2 cm，試驗(yàn)過(guò)程中處理3組平行，置于相同的培養(yǎng)條件下，50 d后對(duì)其成果率和污染率進(jìn)行記錄，確定最佳滅菌方案。具體處理見(jiàn)表1，滅菌結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 鐵皮石斛外植體滅菌方法Tab.1 The sterilization methods for explants of Dendrobium officinale

從表2中污染率和成活率的對(duì)比可知，滅菌效果最好的最別分別是編號(hào)8、5、6，根、莖、芽的污染率依次為5%、3%、2%；成活率最高的是編號(hào)5、8、1成活率為98%、97%、93%。

表2 不同方法的滅菌結(jié)果Tab.2 The sterilization results of different methods

2.2 原球莖的誘導(dǎo)

2.2.1 培養(yǎng)基的選擇

鐵皮石斛根、莖、芽分別接種至MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS 4種基本培養(yǎng)基中30 d，誘導(dǎo)出原球莖的順序依次為莖部、根部和芽。且MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)率最高，依次為90%、80%和70%；比較發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生鐵皮石斛生長(zhǎng)的速率及增值質(zhì)量明顯高于1/2MS、1/4MS、1/8MS培養(yǎng)基（見(jiàn)圖1）。

2.2.2 激素的選擇

原球莖誘導(dǎo)過(guò)程中激素發(fā)揮著重要的作用，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料可知，6-BA處理后可誘導(dǎo)愈傷組織的形成，KT可促愈傷組織分化，NAA、IBA、2,4-D等對(duì)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[5]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選取6-BA、NAA、2，4-D3種對(duì)誘導(dǎo)影響相對(duì)較大的激素進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，進(jìn)而得到不同種類的激素搭配比例對(duì)于愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程所產(chǎn)生的影響。其結(jié)果如表3所示。

表3 原球莖誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)Tab.3 The orthogonal experiment of protocorm induction

其中，MS+6-BA（0.4mg/L）+NAA（0.8mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L瓊脂+3%蔗糖在鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)過(guò)程中的誘導(dǎo)率最高，其最終誘導(dǎo)率為89%。極值R分析結(jié)果表明6-BA、NAA、2，4-D對(duì)其誘導(dǎo)影響次序?yàn)?-BA>NAA>2,4-D，對(duì)K值進(jìn)行分析可知最優(yōu)的搭配方案為A2B3C1與表中6號(hào)組相吻合，因此原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L瓊脂+3%蔗糖，其培育結(jié)果如圖2中所示。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2，4-D施加濃度過(guò)高后會(huì)導(dǎo)致培育的愈傷組織出現(xiàn)黃化或者褐化的現(xiàn)象，試驗(yàn)設(shè)置不同2，4-D的濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1）對(duì)其進(jìn)行相關(guān)培養(yǎng)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2，4-D的施加濃度高于0.6 mg/L時(shí)，部分培育中的原球莖出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，2，4-D的施加濃度越高，其培育過(guò)程中越容易死亡，這與羅吉鳳等及侯艷霞等研究所得出的結(jié)果相一致[7,8]。

2.3 原球莖增殖

在上文基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化鐵皮石斛原球莖的組培增殖體系，旨在提高其組培繁殖速度。

2.3.1 激素的選擇

試驗(yàn)選取KT、NAA、2，4-D 3種對(duì)原球莖增殖過(guò)程影響相對(duì)較大的激素進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，進(jìn)而得到不同種類的激素搭配比例對(duì)于原球莖生長(zhǎng)過(guò)程所產(chǎn)生的影響。結(jié)果如表4所 示，其 中MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L瓊脂+3%蔗糖在鐵皮石斛原球莖增殖過(guò)程中的增值倍數(shù)最高，可達(dá)到3.5倍的增殖效果。極值R分析結(jié)果 表 明KT、NAA、2，4-D、瓊 脂 對(duì) 其 誘 導(dǎo) 影 響 次 序 為2,4D>NAA>KT>瓊脂，對(duì)K值進(jìn)行分析可知最優(yōu)的搭配方案為A2B3C1D2、A3B3C1D2，其中A2B3C1D2與表中6號(hào)組相吻合，后續(xù)試驗(yàn)對(duì)A3B3C1D2進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證得到3.0的增殖倍數(shù)，與A2B3C1D2的3.5倍增值倍數(shù)相比略低，因此6號(hào)組為原球莖增殖的最佳配比，其培養(yǎng)基配方為MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20g/L瓊脂+3%蔗糖。

表4 原球莖增殖過(guò)程激素正交實(shí)驗(yàn)分析Tab.4 The orthogonal experiment analysis of hormones in the process of protocorm proliferation

2.3.2 不同氮磷比對(duì)原球莖增殖的影響

氮和磷是MS母液中的大量元素，植物順利的培養(yǎng)與氮和磷這2種元素關(guān)系密切。王光遠(yuǎn)等對(duì)鐵皮石斛花芽進(jìn)行組織培養(yǎng)過(guò)程中研究發(fā)現(xiàn)，MS中硝酸鉀和磷酸二氫鉀的濃度對(duì)芽繁殖在一定程度上具有抑制作用[8]，其具體表現(xiàn)為KNO3和KH2PO4在組培過(guò)程中的添加濃度越高，其組培植物的增殖系數(shù)則會(huì)越低。

原球莖在MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L瓊脂+3%培養(yǎng)基含有不同氮磷比的條件下培養(yǎng)50 d，每隔15 d對(duì)其增殖鮮質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)，如表5所示，通過(guò)表5可以看出在KNO3和KH2PO4濃度為950 mg/L、350 mg/L時(shí)，其增殖倍數(shù)可達(dá)到最高為1.07倍，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可以直觀發(fā)現(xiàn)KNO3和KH2PO4的濃度越高，增殖倍數(shù)越低，與王光遠(yuǎn)等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

表5 不同氮磷比對(duì)原球莖增殖影響Tab.5 The effects of different nitrogen and phosphorus ratios on the proliferation of protocorm

2.4 原球莖的懸浮培養(yǎng)

在試驗(yàn)過(guò)程中原球莖通過(guò)懸浮培養(yǎng)的模式進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增其結(jié)果相較于傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基培育模式可以獲得更加優(yōu)異的效果。本研究在不同的培養(yǎng)基上設(shè)計(jì)差異化的激素比例從中篩選出最佳的懸浮培養(yǎng)基配方。

2.4.1 培養(yǎng)基組成的篩選

分別在MS、B5、1/2MS中添加3%蔗糖、0.4 mg/L 6-BA、0.8 mg/L NAA，選擇生長(zhǎng)一致的原球莖進(jìn)行培育，每15 d記錄一次，50 d后統(tǒng)計(jì)其鮮質(zhì)量。

從表6中可以看出，采用懸浮培養(yǎng)的方式對(duì)原球莖進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中，B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)其增殖倍數(shù)可以達(dá)到最高，達(dá)到了3.45倍，含糖量可達(dá)9.56%。經(jīng)試驗(yàn)論證最優(yōu)的培養(yǎng)基確定為B5+3%蔗糖+6-BA+NAA。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)原球莖增殖和多糖所產(chǎn)生的影響Tab.6 The effects of different media on the proliferation of protocorm and polysaccharides

2.4.2 不同激素含量對(duì)懸浮培養(yǎng)的影響

以B5+6-BA+NAA+3%蔗糖為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)50 d，期間記錄其鮮質(zhì)量值，據(jù)鮮質(zhì)量值選擇最優(yōu)的培養(yǎng)激素比例。從表7中可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的提高，原球莖的鮮質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，在NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，當(dāng)6-BA濃度為0.4 mg/L，原球莖鮮質(zhì)量均達(dá)到2.86 g；在6-BA濃度為0.2 mg/L，NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，原球莖鮮質(zhì)量達(dá)到2.81g；6-BA濃度為1 mg/L，NAA為1 mg/L，原球莖的鮮質(zhì)量為1.79 g。結(jié)果表明，在NAA施加濃度較低時(shí)，適當(dāng)提高6-BA的濃度，可以有效促進(jìn)其增殖效果。在6-BA濃度較低時(shí)，適當(dāng)提高NAA濃度，反而對(duì)其增殖具有一定的抑制作用。

表7 不同激素含量對(duì)原球莖懸浮培養(yǎng)的影響Tab.7 The effects of different hormone content on suspension culture of protocorm

3 結(jié)論

本研究采用種子萌發(fā)后所挑選獲得的性狀優(yōu)良的鐵皮石斛為組培外植體所需的材料，誘導(dǎo)原球莖產(chǎn)生，并對(duì)鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)基的關(guān)鍵因素進(jìn)行分析篩選，對(duì)鐵皮石斛原球莖的組培增殖體系進(jìn)行了相關(guān)的完善及優(yōu)化，通過(guò)對(duì)鐵皮石斛組培過(guò)程中生長(zhǎng)發(fā)育的幾種關(guān)鍵因素的研究從而確定了不同培養(yǎng)狀態(tài)下的最優(yōu)培養(yǎng)基，分別論證了誘導(dǎo)過(guò)程、增殖過(guò)程、液體懸浮培養(yǎng)過(guò)程，從而為鐵皮石斛的大規(guī)?；斯づ囵B(yǎng)方式提供了切實(shí)可行的數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，在組培過(guò)程中基礎(chǔ)培養(yǎng)基和激素均會(huì)對(duì)植株的培育過(guò)程產(chǎn)生較為顯著的影響，通過(guò)大量的正交實(shí)驗(yàn)及對(duì)比分析最終所得到的優(yōu)化方案為：

（1）原球莖誘導(dǎo)過(guò)程最優(yōu)培養(yǎng)基配比方案為：MS+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20 g/L瓊脂+3%蔗糖。

（2）原球莖增殖過(guò)程最優(yōu)配方為：MS+KT（0.4 mg/L）+NAA（0.8 mg/L）+2，4-D（0.2 mg/L）+20g/L瓊脂+3%蔗糖。

（3）懸浮培養(yǎng)最優(yōu)配方為：B5+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）+3%蔗糖。

在培養(yǎng)基的變更過(guò)程中經(jīng)過(guò)相應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)氮磷比對(duì)于組培植物有著較為顯著的影響，組培過(guò)程中隨著KNO3和KH2PO4在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含量的逐漸升高，其組培植物的增殖系數(shù)會(huì)出現(xiàn)顯著的降低。