王耀祺，蔡鷹，康信煌，鄧春梅，吳育廉，張國(guó)光

（廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088）

作為 “無(wú)脊椎動(dòng)物獻(xiàn)血冠軍”的鱟，其血液中蘊(yùn)含了許多珍貴的活性物質(zhì)［1］。但是，其生物利用度較低，因此，本研究以殼寡糖、HA為原料，制備負(fù)載鱟血蛋白的微球，以提高其生物利用度。同時(shí)研究包載不同分子量鱟血蛋白的微球?qū)Ζ?葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶的抑制活性，為中國(guó)鱟藥用和保健價(jià)值的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供更為豐富的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

二級(jí)膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī)；核酸蛋白檢測(cè)儀；酶標(biāo)分析儀；冷凍干燥機(jī) （上海田楓實(shí)業(yè)有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；掃描電鏡；Zeta電位及粒度分析儀；低溫高速離心機(jī)

1.2 藥品與試劑

蛋白酶抑制劑Cocktail、胰蛋白酶、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、5，5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸、硫代乙酰膽堿、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、殼寡糖、透明質(zhì)酸鈉

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟血蛋白的提取

根據(jù)文獻(xiàn)［2-3］的方法，提取小于150、150～3000、大于3000的3段不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍的蛋白水解物A、B和C。本文以水解物C作為被包載物進(jìn)行表征。

2.2 鱟血蛋白-COS-HA微球的制備

精密稱取5mg鱟血蛋白水解物，加入到含TPP的HA溶液中使其溶解。在攪拌條件下，將溶解好TPP、鱟血蛋白的HA溶液逐滴加入到殼寡糖水溶液中，攪拌30 min，即得鱟血蛋白-COS-HA微球混懸液，冷凍干燥后即得凍干粉。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以微球包封率為指標(biāo)，通過(guò)探究殼寡糖濃度、pH值、HA和TPP的濃度優(yōu)化最適條件。每個(gè)因素采用三個(gè)水平，按照L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，因素表見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交設(shè)計(jì)因素表

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果分析表

由表2可知，微球制備的最佳條件為A1B2C2D2，即當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度為2 mg／mL、HA質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL、TPP質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL及溶液pH為4.5時(shí)為最佳條件。

2.4 微球的表征

2.4.1 粒徑與表面形貌

取微球混懸液置于掃描電鏡中觀察表面形貌及測(cè)量尺寸，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 COS-HA微球的SEM圖

由圖1可知，鱟血蛋白-COS-HA微球呈球形或類球形，大小較均一，粒徑為 （3.11±0.42）μm。

2.4.2 Zeta電位的測(cè)定

取微球適量，用適量蒸餾水稀釋，置于Zeta電位及粒度分析儀中測(cè)定。結(jié)果，Zeta電位測(cè)定值為（-34.35±2.66）mV，體系穩(wěn)定。

2.4.3 包封率和載藥量的測(cè)定

1）鱟血蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。稱取鱟血蛋白5mg，添加PBS緩沖液配制成0.1mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液。取6只試管依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，再補(bǔ)充PBS溶液至1 mL，各加入5 mL考馬斯亮藍(lán)?；靹蚝?，在室溫下靜置2 min，以1號(hào)管作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595 nm處，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A＝6.615c+0.087，r＝0.9994。

2）包封率和載藥量的計(jì)算。在4℃條件下，將微球混懸液離心 （4000 r／min）20 min，分離上清液與沉淀。取上清液，于595 nm處測(cè)定鱟血蛋白的含量。沉淀用純化水洗滌，經(jīng)冷凍干燥24 h后稱重即得載藥微球凍干粉。

計(jì)算公式：

包封率＝（W總-W游）／W總×100%；

載藥量＝（W總-W游）／微球質(zhì)量×100%。

式中，W總為鱟血蛋白總藥量；W游為上清液中游離的鱟血蛋白藥量。

結(jié)果，包封率為 （60.57±0.52）%，載藥量為 （63.02±2.13）%。

2.4.4 體外釋放實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取一定量載藥微球、游離蛋白，混懸于3 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中，使?jié)舛冗_(dá)到3 mg／mL，置于透析袋內(nèi) （截留量70 kDa）懸浮于含有30 mL釋放介質(zhì)的燒杯內(nèi)，在37℃下恒溫振蕩 （100 r／min），分別在 1、2、3、5、7、9、12 h各準(zhǔn)確取出1 mL釋放介質(zhì)，并添加等量介質(zhì)。取出的釋放介質(zhì)于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算藥物的累積釋放率，并繪制體外釋放曲線。結(jié)果見(jiàn)圖2。

Q＝〔Cn×V0+（C1+C2+C3+……+Cn-1） ×V〕／m

圖2 鱟血蛋白原液與載藥微球的體外釋放曲線

由圖2可知，在第5h，鱟血蛋白原液累積釋放率達(dá)到91.01%，而載藥微球累積釋放率僅為43.21%，12 h后，鱟血蛋白原液基本釋放完全，而載藥微球僅釋放46.23%，說(shuō)明具有緩釋效果。

2.5 微球?qū)Ζ?葡萄糖苷酶的抑制活性

按照文獻(xiàn)方法［4］，取樣品混懸液加入酶液，37℃孵化10min，再加入底物，37℃反應(yīng)30 min，測(cè)定A405，計(jì)算酶抑制活性，以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水作為空白對(duì)照。

抑制率 ＝ 〔1-（As-Ac） ／Ab〕 ×100%

結(jié)果可知，水解物微球A和B對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力都隨質(zhì)量濃度增加而增長(zhǎng)；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg／mL時(shí)，兩者最大抑制率分別達(dá)到（14.57±0.50）%和（14.21±0.60）%，水解物C微球則對(duì)α-葡萄糖苷酶基本沒(méi)有抑制活性，但都少于阿卡波糖的最大抑制率（28.42±0.20）%。

2.6 微球?qū)σ阴Ｄ憠A酯酶的抑制活性

參照Ellman＇s比色法，取樣品溶液加入乙酰膽堿酯酶液、5，5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸溶液和PBS溶液，于37℃孵化2 min，然后加入硫代乙酰膽堿溶液，37℃孵化30 min，測(cè)定A410，以石杉?jí)A甲作為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水作為空白對(duì)照。按上式計(jì)算酶抑制活性。

結(jié)果可知，在0～0.04 mg／mL范圍內(nèi)，微球和石杉?jí)A甲抑制乙酰膽堿酯酶的能力均隨濃度的增加而增加；達(dá)到0.04 mg／mL后，酶抑制能力不再顯著增長(zhǎng)。與石杉?jí)A甲最高抑制率（99.22±0.60）%相比，微球水解物A和B的最高抑制率分別為（43.92±0.40）%和（30.58±0.50）%，微球水解物C的酶抑制活性最好為（67.45±0.20）%。

3 討論

本研究從鱟血中成功提取并水解分離得到三種不同分子量的鱟血蛋白水解物并將其制備成鱟血蛋白殼寡糖-透明質(zhì)酸微球，其生物相容性高，藥物釋放具有明顯的緩釋效果，三種蛋白水解物微球?qū)Ζ?葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶具有一定抑制作用。